轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的研究

1、轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的研究摘要：在已建立的紫花苜蓿Medicagosativa體細(xì)胞胚高頻再生體系的基礎(chǔ)上，研究了侵染時(shí)間、負(fù)壓處理、預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)時(shí)間、脫菌及選擇方法等因子對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，并初步獲得了抗性體肚。關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；體細(xì)胞胚；根癌農(nóng)桿菌；AziVHXl遺傳轉(zhuǎn)化土壤鹽堿化是人類面臨的世界性難題。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球約有9.5X10shmz鹽堿地，分布于100多個(gè)國(guó)家，其中中國(guó)的鹽漬地面積約為9.9X107hm2并有逐年擴(kuò)大的趨勢(shì)通過

2、生物技術(shù)培育耐鹽作物品種是改良利用大面積鹽荒地、緩解我國(guó)現(xiàn)有人口對(duì)土地壓力的有效措施之—。紫花巷猜Medicagusativa素有“牧草之王”的美稱，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和廣泛的生態(tài)適應(yīng)性[3]。研究表明，在鹽堿地上種植紫花苜蓿可以顯著改善鹽潰土的理化性質(zhì)，降低土壤含鹽量[1]。但由于紫花苜蓿數(shù)千年來(lái)生長(zhǎng)在低鹽或非鹽漬化土壤中，其抗鹽能力較弱，屬于中等抗鹽作物，所以較難在鹽堿地上種植。Na是造成植物鹽害的主要離子之一。植物細(xì)胞抵御其內(nèi)部鹽

3、脅迫的主要方式是將細(xì)胞內(nèi)過多的Na泵人液泡，這一過程是由液泡膜NaH逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（AtNHXl)完成的。將抗鹽基因AfNHXl轉(zhuǎn)人其它作物如番前Lycopersiconesculentum[5]、油菜Brassicanapus[6]、小麥Tritivumaestivum[7]和玉米Zeama0yS[8]等已有許多成功報(bào)道，而且抗鹽基因UNHX1的表達(dá)確實(shí)能夠明顯提高上.Advancesinstudiesongeictransfmatio

4、noftallfescueWUGuantingCHENJinqing(InstituteofVirologyBiotechnology?ZhejiangAcademyofAgriculturalSciencesHangzhou310021China)Abstract：Tallfescue(Festucaarundinacea)isanimptantperennialcool~seasongrassspecieswidelyplanted

5、ffageturfpurposesintemperateregionsthroughoutthewld.Falongtime，tallfescuehasbeenimprovedbytraditionalbreeding.Advancesintransgenictechnologyhaveprovidedaneffectivewayfdevelopmentofnewcultivarsoftallfescue.Atpresentstudie

6、stoimprovetolerancestoadverseenvironments，resistancestodiseasespestsherbicidesaswellasqualitytraitsofthisgrassspeciesbygeicengineeringarebeingcarriedoutinalotofcompanieslabatiesathomeabroad.Inthispaper，progressesingeictr

7、ansfmationoftallfescuewerereviewedintermsofrecipientmaterialstransfmationmethods，targetgenesinfluencingfactstransgeneinheritance.Keywds：Tallfescuegeicengineering；recipientmaterial；transfmationmethod；transgene；inheritance

8、下胚軸出愈率隴東下胚軸出愈率大葉體胚分化率隴東—o體胚分化率大葉oooo050100Kan濃度(mg10圖3卡那霉素（Kan)對(duì)紫花苢蓿下胚軸和體莊的影響8642%)鱭傘^培養(yǎng)3周；而液體脫菌是將共培養(yǎng)后的外植體先轉(zhuǎn)人加有200mgLCarb的MSH液體培養(yǎng)基中180rpm振蕩洗滌3d，然后用無(wú)菌濾紙吸干外植體上的液滴，再轉(zhuǎn)移到固體脫菌培養(yǎng)基MSH200mgLCarb上24C暗培養(yǎng)2周，然后24C，16hd光照培養(yǎng)1周。在對(duì)抗性體胚進(jìn)行

9、選擇時(shí)，同時(shí)采取了前期選擇和延緩選擇2種方法。前期選擇就是共培養(yǎng)后，在脫菌培養(yǎng)基MSH200mgLCarb中同時(shí)加人50mgLKan延緩選擇是指共培養(yǎng)后，先在MSH200mgLCarb培養(yǎng)基上進(jìn)行脫菌培養(yǎng)3周，之后將脫菌的胚性愈傷轉(zhuǎn)人SHMmgLKan100mgLCarb上暗培養(yǎng)10d，再光照培養(yǎng)10d。在后續(xù)繼代中去掉Carb，直到有成熟體胚形成（有不定芽產(chǎn)生）。2結(jié)果與分析2.1抗生素抑菌濃度的確定Carb是植物基因工程中經(jīng)常使用的

10、一種脫菌抗生素。LBA4404是紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化中使用最多的一種根癌農(nóng)桿菌Carb的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖2)，該農(nóng)桿菌菌株LBA4404對(duì)Carb特別敏感，在Carb濃度為100、200和500mgL，ODwl值分別為0.019、0.016和0.015，且在Carb濃度為200500mgL時(shí)，()D6。。值基本沒有變化。由此可見，200mgL的Carb便可完全抑制農(nóng)桿菌LBA4404的生長(zhǎng)，這與Shao等D1]發(fā)現(xiàn)的LBA4404對(duì)Ca

11、rb較為敏感的結(jié)果相一致。所以，在本實(shí)驗(yàn)中選用200mgL的Carb作為L(zhǎng)BA4404的脫菌濃度。0.2■0.00100200300400500Carb濃度（mgL)圖2羧芐青霉素(Carb)對(duì)農(nóng)桿菌LBA4404生長(zhǎng)的影響2.2選擇培養(yǎng)基中Kan選擇壓的確定不同的植物材料對(duì)Kan的敏感性或抗性會(huì)有所不從圖3可以看出，當(dāng)Kan濃度為50mgL時(shí)，隴東苜蓿下胚軸出愈率為5%，大葉苜蓿下胚軸出愈率為7%。而當(dāng)Kan濃度為80mg丨：時(shí)，仍不

12、能將其有效殺死。只有Kan濃度增加到100mgL時(shí)，隴東和大葉苜蓿下胚軸出愈率才都降為0。由此可知，Kan對(duì)紫花苜蓿下胚軸的最佳選擇壓為100mgL。從圖3還可以看出，與下胚軸相比，當(dāng)Kan濃度為40mgL時(shí)，隴東和大葉苜蓿體胚分化率均已降至2%當(dāng)Kan濃度在50mgL以上時(shí)，隴東和大葉苜蓿體胚均不能分化出不定芽，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，大部分體胚停止發(fā)育并褐化死亡。所以，對(duì)紫花苜蓿體胚而言，Kan最佳濃度選擇為50mgL。2.3對(duì)轉(zhuǎn)化效率

13、的影響在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)OD_低于0.5時(shí)，被侵染的下胚軸和體胚沒有出現(xiàn)褐化腐爛的現(xiàn)象，但也沒有得到抗性愈傷或體胚。而當(dāng)（)D_大于0.7時(shí)，在篩選培養(yǎng)基上，下胚軸和體胚均出現(xiàn)了大量褐化和腐爛的現(xiàn)象。在（)0_為0.5?0.7時(shí)，侵染的下胚軸和體胚基本上沒有出現(xiàn)腐爛的現(xiàn)象，在篩選培養(yǎng)基同。所以，在實(shí)驗(yàn)過程中，根據(jù)植物材料的不同，篩選出一個(gè)能將未轉(zhuǎn)化細(xì)胞殺死，而又能使轉(zhuǎn)化細(xì)胞存活下來(lái)的Kan臨界濃度至關(guān)重要。研究也發(fā)現(xiàn)，不同的紫花苜蓿品種和