紫花苜蓿MsIPI基因克隆及對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、紫花苜蓿重要次生代謝產(chǎn)物皂苷屬萜類化合物，異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl diphosphate isomerase,簡(jiǎn)稱IPI)是植物體萜類化合物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，其作用是將直接用于萜類合成的兩個(gè)基本物質(zhì)IPP和他的異構(gòu)物DMAPP在一定條件下進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化。紫花苜蓿是優(yōu)良的豆科牧草，目前在我國(guó)及世界各地都有大量栽培利用，其中所含皂苷具有重要的生物活性和藥理作用。通過對(duì)異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶基因的研究，對(duì)于提高和控制其

2、在植物體內(nèi)的生化活性具有重要意義。
　　對(duì)已公布的異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶EST序列進(jìn)行搜索和比對(duì)，選取了與紫花苜蓿親緣關(guān)系最近的蒺藜苜蓿的IPI基因EST序列為基準(zhǔn)設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增獲得MsIPI基因cDNA全序列。該基因開放閱讀框全長(zhǎng)870bp，編碼290個(gè)氨基酸殘基。利用DNAMAN對(duì)該基因的氨基酸序列進(jìn)行了生物性息學(xué)分析，經(jīng)同源比對(duì)和進(jìn)化樹分析，MsIPI基因的氨基酸序列與蒺藜苜蓿、煙草、擬南芥、水稻、高粱的

3、異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶氨基酸序列一致性達(dá)到90℅以上。
　　植物的表達(dá)載體構(gòu)建，是將獲得的EST序列插入到植物表達(dá)載體pBI121上，構(gòu)建了超表達(dá)MsIPI基因的表達(dá)載體pBI-IPI，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，以期得到MsIPI基因超量表達(dá)的煙草轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)再生植株進(jìn)行抗生素篩選和PCR、RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果6株呈現(xiàn)陽性，證實(shí)目的基因已經(jīng)整合到煙草基因組中，已獲得了轉(zhuǎn)基因植株。通過GUS基因組織化學(xué)染色