生物化學(xué)第6章蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

1、第6章 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,一、肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能二、血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能三、血紅蛋白分子病四、免疫系統(tǒng)和免疫球蛋白五、肌球蛋白絲、肌動(dòng)蛋白絲與肌肉收縮六、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)化,(The relation between structure and function of proteins),一、肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能,,肌紅蛋白,肌紅蛋白（myoglobin，Mb）主要存在于肌肉中，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞主要是肌細(xì)胞貯存和分

2、配氧的蛋白質(zhì)。肌紅蛋白由一條多肽鏈和一個(gè)輔基血紅素（heme）構(gòu)成，相對(duì)分子量16700，含153個(gè)氨基酸殘基。除去血紅素后僅剩下的肽鏈部分稱為珠蛋白（globin），它和血紅蛋白的α、β亞基有明顯的同源性，它們的構(gòu)象和功能也極為相似。血紅素非共價(jià)地結(jié)合在珠蛋白的疏水空穴中。,,肌紅蛋白的結(jié)構(gòu),myoglobin,輔基血紅素,血紅素由原卟啉Ⅸ（protoporphyrin Ⅸ）中間結(jié)合一個(gè)Fe原子構(gòu)成，原卟啉Ⅸ是由4個(gè)吡咯環(huán)通過甲叉橋連

3、接而成的扁平環(huán)狀化合物。卟啉環(huán)中央結(jié)合Fe原子，F(xiàn)e原子通常是八面體配位，應(yīng)該有6個(gè)配位鍵，其中4個(gè)配位鍵與4個(gè)吡咯環(huán)的N原子相連，另兩個(gè)配位鍵分布在卟啉環(huán)的上下。Fe原子可以是二價(jià)的或三價(jià)的，相應(yīng)的血紅素稱為[亞鐵]血紅素（ferroheme，heme）和高鐵血紅素（ferriheme，hematin），相應(yīng)的肌紅蛋白稱為[亞鐵]肌紅蛋白（ferromyoglobin）和高鐵肌紅蛋白（ferrimyoglobin，metmyoglob

4、in）。,肌紅蛋白的輔基血紅素,heme,protoporphyrin Ⅸ,O2與肌紅蛋白的結(jié)合,,血紅素中的鐵的第5個(gè)配位鍵與珠蛋白的第93（或F8）位His殘基的咪唑基N結(jié)合，這個(gè)His稱為近側(cè)His，而O2與Fe的第6個(gè)配位鍵結(jié)合。在肌紅蛋白沒有結(jié)合O2時(shí)，這個(gè)部位是空的。高鐵肌紅蛋白不能與O2結(jié)合，H2O分子代替O2成為第6個(gè)配體。 在血紅素結(jié)合O2的一側(cè)，還有一個(gè)His殘基，即第64（或E7）位His殘基，稱為遠(yuǎn)側(cè)Hi

5、s。由于這個(gè)遠(yuǎn)側(cè)His的存在，使得O2的結(jié)合受到空間位阻。在氧合肌紅蛋白中， O2的兩個(gè)原子與Fe不成一條直線，而是傾斜了30°。,氧合肌紅蛋白中血紅素鐵離子的6個(gè)配體,近側(cè)His,遠(yuǎn)側(cè)His,CO的毒性作用,第6個(gè)配位位置的空間位阻很重要。游離在溶液中的鐵卟啉結(jié)合CO的能力比結(jié)合O2強(qiáng)25000倍，但在肌紅蛋白中，血紅素對(duì)CO的親和力僅比對(duì)O2的親和力大250倍。肌紅蛋白（還有血紅蛋白）降低對(duì)CO的親和力，可以有效地防止代謝

6、過程中產(chǎn)生的少量CO占據(jù)它們的O2結(jié)合部位。盡管如此，當(dāng)空氣中CO的含量達(dá)到0.06%～0.08%即有中毒的危險(xiǎn)，達(dá)到0.1%則會(huì)導(dǎo)致死亡。,O2和CO與肌紅蛋白血紅素Fe（Ⅱ）的結(jié)合,Free hemewith imidazole,Mb:CO Complex Oxymyoglobin,肌紅蛋白的蛋白質(zhì)部分的作用,通常情況下，O2分子與Fe（Ⅱ）緊密接觸會(huì)使Fe（Ⅱ）氧化成Fe（Ⅲ），溶液中游離的亞鐵血紅素很容易被氧化成高鐵血紅

7、素，但在肌紅蛋白中，由于血紅素處于疏水環(huán)境中，血紅素Fe（Ⅱ）不容易被氧化。 同樣是血紅素，與不同的蛋白質(zhì)結(jié)合后，具有不同的功能，如在細(xì)胞色素C中，血紅素起可逆電子載體的作用，過氧化氫酶中，血紅素催化H2O2歧化成H2O和O2 。,肌紅蛋白血紅素Fe原子的位移,肌紅蛋白血紅素在沒有與O2結(jié)合時(shí)，鐵原子是向第 5 配位體方向（His F8）突出的。當(dāng)與O2結(jié)合時(shí)，鐵原子被拉回到卟啉平面。,肌紅蛋白血紅素Fe原子的位移,肌紅蛋白結(jié)合

8、氧的定量分析,肌紅蛋白與O2結(jié)合的反應(yīng)式為,其解離常數(shù)為K ,,…………①,令Y 為肌紅蛋白的氧飽和分?jǐn)?shù)，即,…………②,將①改寫為,…………③,肌紅蛋白結(jié)合氧的定量分析,將③代入②得 ，,…………④,根據(jù)henry定律，溶于液體的任一種氣體的濃度與液體上面的該氣體的分壓成正比，即,,[O2]= A p (O2) …………⑤,式中A 為比例系數(shù)，p (O2)為氧氣的分壓。,,肌紅蛋白結(jié)合氧的定量分析,將

9、⑤代入④得,…………⑥,肌紅蛋白的氧結(jié)合曲線,實(shí)驗(yàn)中 p (O2) 可以測(cè)得，氧分壓常用Torr為單位。Y 值可用分光光度法測(cè)定，因?yàn)榧〖t蛋白結(jié)合了O2 時(shí)會(huì)引起吸收光譜的改變。Y 對(duì) p (O2) 作圖所得的曲線稱為氧結(jié)合曲線。,,1 Torr = 133 Pa = 1 mmHg,肌紅蛋白的氧結(jié)合曲線,雙曲線方程,Hill作圖,為氧結(jié)合肌紅蛋白的分?jǐn)?shù)與沒有結(jié)合氧的肌紅蛋白的分?jǐn)?shù)之比。,,,兩邊取對(duì)數(shù)得,,,Hill作圖,以

10、 對(duì) 作圖稱為Hill作圖，肌紅蛋白的Hill圖是一條直線。當(dāng) 時(shí)（50%的肌紅蛋白結(jié)合了氧）， ，這時(shí) ，這一點(diǎn)的斜率稱為Hill系數(shù)，肌紅蛋白的Hill系數(shù)等于1，說明O2分子彼此獨(dú)立地與肌紅蛋白結(jié)合。,,,,,,氧與肌紅蛋白結(jié)合的Hill圖,肌紅蛋白的貯氧和輸氧作用,線粒體中氧濃度為0～10 torr，靜脈血

11、氧濃度為15 torr或更高些。肌紅蛋白的P 50為2 torr，所以在大多數(shù)情況下，肌紅蛋白是高度氧合的，是氧的貯存庫(kù)。如果由于肌肉收縮使線粒體中氧含量下降，它就可以立即供應(yīng)氧。,肌紅蛋白的貯氧和輸氧作用,肌紅蛋白也有利于細(xì)胞內(nèi)氧從細(xì)胞的內(nèi)表面向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)，因?yàn)檫@種運(yùn)轉(zhuǎn)是順濃度梯度的，細(xì)胞內(nèi)表面的氧濃度約為10 torr（肌紅蛋白的氧飽和度約為80%），而線粒體內(nèi)的氧濃度約為1 torr（肌紅蛋白的氧飽和度約為25%），肌紅蛋白可以從

12、細(xì)胞內(nèi)表面結(jié)合氧，而運(yùn)到線粒體中釋放氧。,二、血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能,血紅蛋白,血紅蛋白（hemoglobin，Hb）存在于紅細(xì)胞中，它的主要功能是在血液中結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)氧氣，它在肺中與氧氣結(jié)合，運(yùn)輸?shù)饺砀魈幗M織中，再釋放出氧氣。,人體內(nèi)有正常功能的血紅蛋白,血紅蛋白的氨基酸組成,α鏈或α樣鏈由141個(gè)氨基酸殘基組成，β鏈或β樣鏈由146個(gè)氨基酸殘基組成，而肌紅蛋白的肽鏈由153個(gè)氨基酸殘基組成，它們都叫珠蛋白。同一類型不同希臘字母代表的鏈

13、有個(gè)別氨基酸殘基不同。,血紅蛋白的三維結(jié)構(gòu),β1,β2,α1,α2,Hb的α鏈、β鏈和Mb鏈構(gòu)象的相似性,血紅蛋白α鏈、β鏈及肌紅蛋白鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似，但這三種肽鏈的氨基酸序列有很大不同，141個(gè)氨基酸殘基位置中只有27個(gè)位置的殘基在這三種肽鏈中是相同的。,Mb Hbα Hbβ,不同物種血紅蛋白氨基酸序列的比較,比較了多種（從七腮鰻到人）不同的血紅

14、蛋白的氨基酸序列，證明序列中有9個(gè)位置的殘基是所有研究過的血紅蛋白所共有的，這些稱為高度保守的殘基。 血紅蛋白內(nèi)部的非極性殘基可以換成另一種非極性殘基而功能不變。,血紅蛋白氧合時(shí)亞基的移動(dòng),血紅蛋白分子中，αβ亞基的接觸有兩類，一類是α1β1接觸和α2β2接觸，這類接觸稱為裝配接觸；另一類是α1β2接觸和α2β1接觸，這類接觸稱為滑動(dòng)接觸。氧合時(shí)，每個(gè)αβ二聚體半分子作為一個(gè)剛體移動(dòng)，這兩個(gè)二聚體彼此滑動(dòng)。我們將其中一個(gè)二聚體看

15、作不動(dòng)，另一個(gè)二聚體將繞一個(gè)設(shè)想的偏心軸旋轉(zhuǎn)15°，并平移0.08nm。,血紅蛋白氧合時(shí)亞基的移動(dòng),去氧血紅蛋白 α1β1的移動(dòng)過程 氧合血紅蛋白,血紅蛋白氧合時(shí)鐵原子的移動(dòng),在去氧血紅蛋白中，鐵原子向近側(cè)His方向凸起約0.06nm。氧合時(shí)，鐵原子的體積縮小，向卟啉環(huán)平面靠近約0.039nm，并牽拉近側(cè)His往血紅素平面移動(dòng)，這些移動(dòng)，傳遞到亞基的界面，使得亞基間的相互位置發(fā)生變化。,血紅蛋白氧合時(shí)鐵原子

16、的移動(dòng),血紅蛋白的兩種構(gòu)象態(tài),血紅蛋白有兩種主要構(gòu)象態(tài)，一種是T態(tài)即緊張態(tài)（tense state），另一種是R態(tài)即松弛態(tài)（relaxed state）。O2對(duì)R態(tài)的親和力明顯地高于對(duì)T態(tài)的親和力，并且O2的結(jié)合更穩(wěn)定了R態(tài)。缺氧時(shí)T態(tài)更加穩(wěn)定，因此T態(tài)是去氧血紅蛋白的主要構(gòu)象，R態(tài)是氧合血紅蛋白的主要構(gòu)象。T態(tài)血紅蛋白結(jié)合O2后轉(zhuǎn)變成R態(tài)，并使得分子內(nèi)一些鹽橋斷裂。,去氧血紅蛋白中各亞基間的鹽橋,血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng),血紅蛋白是一個(gè)四聚

17、體蛋白，它與肌紅蛋白相比，出現(xiàn)了一些新的性質(zhì)。血紅蛋白的氧合具有正協(xié)同同促效應(yīng)，即一個(gè)O2的結(jié)合促進(jìn)同一分子其它亞基與O2的結(jié)合。具有這種性質(zhì)的蛋白質(zhì)稱為別構(gòu)蛋白（其它蛋白質(zhì)也有負(fù)協(xié)同效應(yīng)的）。,血紅蛋白的協(xié)同性氧結(jié)合,假設(shè)O2與Hb的結(jié)合是一種“全或無”的方式，其結(jié)合反應(yīng)式為,則解離常數(shù)K 為,…………⑦,…………⑧,按照前面肌紅蛋白結(jié)合O2的定量分析的推導(dǎo)方法，Hb的氧飽和分?jǐn)?shù)Y 的表達(dá)式為,血紅蛋白與肌紅蛋白氧合曲線的比較,血紅

18、蛋白的實(shí)際氧合曲線,推導(dǎo)氧合曲線,實(shí)際氧合曲線,圖中的n為Hill系數(shù),血紅蛋白推導(dǎo)氧合曲線誤差的原因,血紅蛋白結(jié)合O2并不是“全或無”的，各個(gè)亞基結(jié)合O2是依次進(jìn)行的，并且前面亞基結(jié)合了O2對(duì)后面亞基與O2的結(jié)合有促進(jìn)作用。實(shí)際測(cè)定的n=2.8，若n=1，則無協(xié)同作用，若n >1則有正協(xié)同作用。對(duì)于血紅蛋白來說，當(dāng) n=4 時(shí)正協(xié)同作用最大，即當(dāng)1個(gè)O2與1個(gè)亞基結(jié)合后，另外3個(gè)亞基也同時(shí)與O2結(jié)合。實(shí)際情況是n=2.8。這樣，

19、Hb對(duì)第4個(gè)O2的親和力約為與第1個(gè)O2親和力的300倍。,血紅蛋白運(yùn)輸氧的效率,在肺泡中，氧分壓為100 torr，工作肌肉的毛細(xì)血管中約為20 torr，血紅蛋白在肺泡中Y是0.97，在肌肉毛細(xì)血管中Y是0.25，釋放的O2是兩個(gè)Y值之差，即ΔY=0.72。這個(gè)差值越大，運(yùn)輸O2的效率就越高。肌紅蛋白不能擔(dān)當(dāng)此項(xiàng)工作。,血紅蛋白別構(gòu)的異種效應(yīng),,血紅蛋白與O2的結(jié)合受其它分子的調(diào)節(jié)，如H+、CO2和2,3-二磷酸甘油酸（2,3-bi

20、sphosphate glycerate，BPG）等。雖然它們?cè)诘鞍踪|(zhì)分子上的結(jié)合部位離血紅素很遠(yuǎn)，但這些分子極大地影響Hb的氧合性質(zhì)，這是別構(gòu)效應(yīng)中的異種效應(yīng)。,2,3-二磷酸甘油酸,2,3-bisphosphate glycerate，BPG,Bohr效應(yīng),組織中代謝作用產(chǎn)生H+和CO2，代謝越旺盛的組織，需要的O2越多，產(chǎn)生的H+和CO2也越多。CO2在體內(nèi)被水合成碳酸。,,CO2水合的結(jié)果，使組織中pH下降，即[H+]上升。 O

21、2與血紅蛋白的結(jié)合受pH和CO2濃度的影響。去氧血紅蛋白對(duì)H+的親和力比氧合血紅蛋白大。因此，增加H+濃度將促進(jìn)O2的釋放。 HbO2 ＋H+ HbH+＋O2,Bohr效應(yīng),氧合血紅蛋白在組織中釋放的O2量除了受到組織中低O2濃度的作用外，還受組織中低pH的影響。后者叫做Bohr效應(yīng)，因1904年發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象的丹麥生理學(xué)家C. Bohr而得名。 產(chǎn)生Bohr效應(yīng)的原因是血紅蛋白中一些

22、pK值處于7附近的可解離基團(tuán)的作用，主要是His，它們解離與否會(huì)影響到血紅蛋白的構(gòu)象，從而影響血紅蛋白對(duì)O2的親和力。,Mb和在不同pH下Hb的氧合曲線,CO2與Hb的結(jié)合,血紅蛋白還能結(jié)合CO2 ，結(jié)合部位是4個(gè)亞基N末端的α－NH2，這些氨基在T態(tài)時(shí)都處于鹽橋中，但R態(tài)時(shí)都以游離狀態(tài)存在。CO2的結(jié)合也能促進(jìn)O2的釋放。,,BPG與Hb的結(jié)合,2,3-二磷酸甘油酸（BPG）是血紅蛋白一個(gè)重要的別構(gòu)效應(yīng)劑（別構(gòu)抑制劑）。正常人紅細(xì)胞中

23、約含有4.5mmol/L的BPG，約與血紅蛋白等摩爾數(shù)。每個(gè)Hb分子（四聚體）只有一個(gè)BPG結(jié)合位點(diǎn)，位于由4個(gè)亞基締合形成的中央孔穴內(nèi)。高負(fù)電荷的BPG分子與每個(gè)β鏈的若干個(gè)殘基的帶正電荷基團(tuán)通過靜電結(jié)合于Hb分子上，BPG把兩個(gè)β鏈交聯(lián)在一起。O2的結(jié)合使中央孔穴變小，使BPG結(jié)合變得困難。在沒有BPG存在時(shí)，O2的結(jié)合容易，而在有BPG存在時(shí)，O2的結(jié)合變得困難。,BPG分子結(jié)構(gòu)及其與Hb兩個(gè)β鏈的離子結(jié)合,BPG對(duì)Hb氧合曲線

24、的影響,BPG對(duì)R態(tài)Hb的親和力至少比對(duì)T態(tài)Hb低一個(gè)數(shù)量級(jí)，BPG對(duì)R態(tài)Hb的親和力大小順序?yàn)椋篐bO2 > Hb(O2)2 > Hb(O2)3 ，而對(duì)Hb(O2)4則完全不結(jié)合。 BPG濃度越大，Hb的氧合曲線就越往右偏移，說明BPG抑制O2的結(jié)合，并增加了正協(xié)同效應(yīng)。BPG的存在可以增加Hb在組織中的卸氧量。正常情況下供給組織的氧量約為血液所能攜帶的最大氧量的40%（即ΔY = 40%）。,BPG對(duì)Hb氧合曲線

25、的影響,BPG的生理作用,人的某些生理性或病理性缺氧可以通過紅細(xì)胞中BPG濃度的升高而代償。當(dāng)正常人在短時(shí)間內(nèi)由海平面上升到4500m高的高山上時(shí)，紅細(xì)胞中的BPG濃度幾個(gè)小時(shí)后就開始上升，兩天內(nèi)可由4.5mmol/L增加到7.5mmol/L，使氧的釋放量增大。值得注意的是，BPG濃度增加對(duì)肺中Hb與O2的結(jié)合影響不大。,三、血紅蛋白分子病,鐮刀狀細(xì)胞貧血病,鐮刀狀細(xì)胞貧血病（sickle-cell anemia）是最早被認(rèn)識(shí)的一種分子

26、病。這種病在非洲某些地區(qū)十分流行（高達(dá)40%），它是由于遺傳基因的突變導(dǎo)致血紅蛋白分子中氨基酸殘基被改變?cè)斐傻?。鐮刀狀?xì)胞貧血病人血紅蛋白含量?jī)H為正常人（15～16g/100ml）的一半，紅細(xì)胞數(shù)目也是正常人（4.6～6.2×106個(gè)/ml）的一半左右，而且紅細(xì)胞的形態(tài)也不正常，除了有非常大量的未成熟紅細(xì)胞外，還有很多成鐮刀狀的紅細(xì)胞。當(dāng)紅細(xì)胞脫氧時(shí)，鐮刀狀紅細(xì)胞的數(shù)量明顯增加。這種病人的血紅蛋白稱為HbS。,正常紅細(xì)胞與鐮刀

27、狀紅細(xì)胞貧血病人的紅細(xì)胞比較,鐮刀狀細(xì)胞貧血病,鐮刀狀細(xì)胞貧血病是一種致死性疾病，它的純合子患者有的在童年就死亡。雜合子患者的壽命也不長(zhǎng)，但它能抵抗一種流行于非洲的瘧疾。這種瘧疾也是一種致死性疾病，甚至具有正常血紅蛋白的人死于這種瘧疾的比例也很高，常常在還沒有繁殖后代就已死去。Hbs雜合子患者對(duì)這種瘧疾有一定的抵抗能力，尚能繁殖后代，這是因?yàn)殡s合子患者加速被感染紅細(xì)胞的破壞而中斷瘧原蟲的生活周期的緣故。,HbA和HbS的胰蛋白酶消化液的

28、指紋圖譜,,（先垂直方向?yàn)V紙層析，后水平方向電泳）,HbA,HbS,HbA和HbS氨基酸序列的比較,HbA H2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…… C端HbS H2N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val -Glu-Lys…… C端 （β鏈） 1 2 3 4 5 6 7 8,（示差異處）,HbS聚集成纖維狀

29、沉淀,β6殘基位于分子表面，當(dāng)Val取代了Glu后，在分子的表面多了一個(gè)疏水基團(tuán)。血紅蛋白的氧合性質(zhì)和別構(gòu)性質(zhì)不受此變化的影響，但這一變化顯著影響了血紅蛋白的溶解度。在去氧血紅蛋白分子表面的另一處有一個(gè)疏水性口袋，正好能與這個(gè)Val側(cè)鏈結(jié)合，它們可以互相聚集成纖維狀沉淀。氧合血紅蛋白表面沒有這個(gè)疏水性口袋，所以只有在缺氧時(shí)，紅細(xì)胞才會(huì)成為鐮刀狀。,HbS聚集成纖維狀,兩股HbS鏈連鎖在一起 14股鏈纖維,地中海貧血,地中海貧

30、血可以由幾條途徑產(chǎn)生：①缺失一個(gè)或多個(gè)編碼血紅蛋白鏈的基因；②所有基因都存在，但一個(gè)或多個(gè)基因發(fā)生無義突變（nonsense mutation），結(jié)果產(chǎn)生縮短了的肽鏈，或發(fā)生移碼突變，產(chǎn)生無功能的肽鏈。③所有基因都可能存在，但突變發(fā)生在編碼區(qū)之外，導(dǎo)致不能轉(zhuǎn)錄，或轉(zhuǎn)錄后的加工不正確。,廣東省是我國(guó)地中海貧血癥發(fā)病率最高的地區(qū)，約有11.07%的人（800萬人）攜帶地中海貧血癥的基因（2005年5月11日中央電視臺(tái)報(bào)道）。,四、免疫系統(tǒng)和

31、免疫球蛋白,（免疫球蛋白部分）,免疫球蛋白，Immunoglobulin, Ig,免疫球蛋白G（Ig G）的結(jié)構(gòu),,免疫球蛋白G的空間填充模型,雞卵清溶菌酶與其抗體的結(jié)合,抗體上的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域,,,雞卵清溶菌酶（抗原）,,雞卵清溶菌酶上突出的Gln121,,,雞卵清溶菌酶與其抗體的結(jié)合,抗體上的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域,,,雞卵清溶菌酶上突出的Gln121,,免疫沉淀的交聯(lián)晶格,交聯(lián)晶格,抗原決定簇,抗原（含4個(gè)決定簇）,抗體,人免疫球蛋白的

32、各種類型,人的免疫球蛋白除了IgG外，還有IgA、IgM、IgD 和 IgE，共有5種類型，它們各自存在于人體的不同部位，起著不同的作用。Ig 分子輕鏈恒定區(qū)（CL）的氨基酸序列可分為兩種基本類型：κ和λ，一個(gè) Ig 分子只能含有其中的一種。重鏈恒定區(qū)（包括CH1、CH2和CH3）的序列分為5種基本類型：γ（IgG）、α（IgA）、μ（IgM）、δ（IgD）和ε（IgE）。,各種Ig的結(jié)構(gòu),IgD的結(jié)構(gòu)與IgG類似,IgG,IgE,Ig

33、A,IgM,IgM的結(jié)構(gòu),,二硫鍵,酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定,enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA,血樣中單純皰疹病毒抗體的ELISA檢測(cè),An ELISA to test for the presence of herpes simplex virus (HSV) antibodies in blood samples. Wells were coated with an HSV antigen,

34、to which antibodies against HSV will bind. The second antibody is antihuman IgG linked to horseradish peroxidase. Blood samples with greater amounts of HSV antibody turn brighter yellow.,血清樣品中單純皰疹病毒抗體的ELISA檢測(cè),酶標(biāo)板或微孔板,尿激酶

35、的免疫印跡測(cè)定,(1,4),(2,5),(3,6)-純化程度逐步增高的尿激酶樣品,免疫印跡,這種檢測(cè)某種蛋白的方法稱為Western blotting,尿激酶單抗檢測(cè),單克隆抗體的制備方法,用目的抗原免疫小鼠，取小鼠脾臟制成B淋巴細(xì)胞懸液；繁殖小鼠骨髓瘤細(xì)胞；將制得的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞；轉(zhuǎn)移到只有雜交瘤細(xì)胞才能生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)； 用ELISA法篩選出能分泌目的抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株；擴(kuò)大培

36、養(yǎng)，從培養(yǎng)液中提取純化單克隆抗體。,五、肌球蛋白絲、肌動(dòng)蛋白絲與肌肉收縮,(肌纖維的結(jié)構(gòu)),脊椎動(dòng)物的骨骼肌又稱橫紋肌或隨意肌。肌肉由許多平行的肌纖維束或稱肌束組成。肌束中的每個(gè)肌纖維就是一個(gè)骨骼肌細(xì)胞，它是長(zhǎng)柱形的多核細(xì)胞，直徑約在20～100μm之間，長(zhǎng)可達(dá)5cm以上，人體的一些肌纖維甚至可達(dá)50cm。肌細(xì)胞間有少量結(jié)締組織，并有毛細(xì)血管和神經(jīng)纖維等。,骨骼肌的組織水平,肌纖維的細(xì)胞水平,肌纖維（肌細(xì)胞）是由多個(gè)稱為成肌細(xì)胞的肌肉前

37、體細(xì)胞融合而成的。每個(gè)肌纖維含有約1000個(gè)肌原纖維，肌原纖維直徑2μm。這些肌原纖維處于肌漿中。核一般處在細(xì)胞的周邊，質(zhì)膜的內(nèi)表面。肌纖維中含有許多線粒體，在肌肉收縮時(shí)提供能源物質(zhì)ATP，肌纖維中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)稱為肌質(zhì)網(wǎng)，分布在各肌原纖維的周圍，肌肉收縮時(shí)由它提供所需的Ca2+。,肌原纖維的結(jié)構(gòu),肌原纖維呈現(xiàn)一個(gè)很有規(guī)則的周期性結(jié)構(gòu)，暗帶和明帶交替排列。明帶折射率是各向同性的，因此又稱各向同性帶（isotropic band），簡(jiǎn)稱 I 帶

38、；暗帶是各向異性的，所以又稱各向異性帶（anisotropic band），簡(jiǎn)稱A帶。I 帶被一條稱為Z線或Z盤的細(xì)線分成相等的兩半。在A帶中央有一個(gè)較明亮的區(qū)域稱為H區(qū)，H區(qū)正中間有一個(gè)致密的橫線，稱為M線或M盤，它將H區(qū)分成相等的兩半。,骨骼肌肌原纖維的電鏡圖,肌 節(jié),一個(gè)肌原纖維可以看成是由許多稱為肌節(jié)（sarcomere）的重復(fù)單位構(gòu)成的，重復(fù)單位是一個(gè)A帶加上前后各半個(gè)I帶，即從Z線到下一個(gè)Z線。一個(gè)肌節(jié)在松馳狀態(tài)下長(zhǎng)度為2

39、.5μm。上述肌纖維結(jié)構(gòu)在光學(xué)顯微鏡下就能觀察到。,肌肉收縮的顯微觀察,在一個(gè)完全的收縮中，每個(gè)肌節(jié)縮短約1.0μm（原長(zhǎng)2.5 μm）。收縮時(shí)I帶和H區(qū)幾乎消失，Z盤向A帶靠攏，也即縮短是由I帶和H區(qū)兩者的寬度減少造成的，但A帶寬度（即粗絲長(zhǎng)度）和Z盤到H區(qū)邊緣的距離（即細(xì)絲長(zhǎng)度）并不改變。,肌原纖維由粗絲和細(xì)絲構(gòu)成,粗絲是由250~360個(gè)肌球蛋白分子通過它們的尾部締合而成的分子束，直徑約為16nm；它們的尾都朝向A帶的中央（H區(qū)）

40、，長(zhǎng)度約為1.5μm。結(jié)構(gòu)中肌球蛋白的頭部有規(guī)則地每間隔約14nm在兩端伸出。粗絲上伸出的頭部與相鄰的細(xì)絲接觸。,（粗絲的結(jié)構(gòu)）,粗絲和細(xì)絲中的分子裝配,,肌原纖維由粗絲和細(xì)絲構(gòu)成,（細(xì)絲的結(jié)構(gòu)）,細(xì)絲由肌動(dòng)蛋白（actin）、原肌球蛋白和肌鈣蛋白復(fù)合體組成，在低離子強(qiáng)度下，肌動(dòng)蛋白以單體的形式存在，稱為G－肌動(dòng)蛋白。在生理?xiàng)l件（高離子強(qiáng)度）下，G－肌動(dòng)蛋白聚合成纖維狀的F－肌動(dòng)蛋白。F－肌動(dòng)蛋白外觀上像是右手雙螺旋結(jié)構(gòu)，螺距約72nm

41、。每7個(gè)肌動(dòng)蛋白分子表面有一條原肌球蛋白分子索，它遮蓋著肌動(dòng)蛋白上能與肌球蛋白結(jié)合的位點(diǎn)。肌鈣蛋白復(fù)合體由3個(gè)蛋白組成，肌鈣蛋白T、I、C。其中T能與原肌球蛋白結(jié)合，C能與鈣離子結(jié)合，I 阻抑肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白結(jié)合。,骨骼肌的相關(guān)蛋白質(zhì),除骨骼肌的主要蛋白質(zhì)外，還有多種蛋白質(zhì)在維持肌肉結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)肌肉收縮方面起著重要的作用。肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白共占總肌絲蛋白質(zhì)的65%，原肌球蛋白和肌鈣蛋白各占5%，其它的調(diào)節(jié)和結(jié)構(gòu)蛋白約占肌絲蛋白質(zhì)的25%

42、。 兩個(gè)細(xì)胞骨架蛋白，肌連蛋白和伴肌動(dòng)蛋白，它們共同形成肌原纖維周圍的柔性絲狀網(wǎng)。,骨骼肌收縮的肌絲滑動(dòng)模型,肌肉收縮的分子機(jī)制,當(dāng)信號(hào)通過神經(jīng)傳至肌細(xì)胞時(shí)，肌細(xì)胞膜去極化，興奮傳至橫小管系（橫小管系是肌膜向內(nèi)凹入形成的細(xì)管，它圍繞在每條肌原纖維的明帶與暗帶交界處的表面，直徑約20～40nm），引起肌質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子至肌漿，鈣離子與細(xì)絲上的肌鈣蛋白C結(jié)合，肌鈣蛋白復(fù)合體發(fā)生構(gòu)象變化，通過肌鈣蛋白I使原肌球蛋白發(fā)生位移，阻抑作用解除

43、，暴露出肌動(dòng)蛋白上與肌球蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，肌肉收縮得以進(jìn)行。,肌肉收縮的分子機(jī)制,肌球蛋白的頭部與肌動(dòng)蛋白絲的結(jié)合,肌肉松弛,肌肉收縮完成后，鈣離子被鈣泵從肌漿中回收到肌質(zhì)網(wǎng)，另一ATP與肌球蛋白的頭部結(jié)合時(shí)，肌球蛋白頭部與肌動(dòng)蛋白脫離，肌球蛋白頭部又回至原位，肌纖維松弛。ATP由線粒體供給，當(dāng)機(jī)體死亡后，線粒體停止產(chǎn)生ATP，無新的ATP與肌球蛋白結(jié)合，因而肌球蛋白頭部不能脫離肌動(dòng)蛋白，使肌肉長(zhǎng)期處于收縮狀態(tài)，稱為尸僵。,肌連蛋白,肌連

44、蛋白是一種彈性蛋白質(zhì)。它是現(xiàn)在已知最大的單鏈蛋白質(zhì)，人的心肌肌連蛋白由26926個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為2993×103。在肌連蛋白分子中央是一個(gè)新的結(jié)構(gòu)花式，由PEVK的重復(fù)單位組成。PEVK花式可能起彈簧裝置的作用，在肌肉伸展之后可拉動(dòng)肌肉恢復(fù)原狀，并且也可能在調(diào)節(jié)肌纖維的強(qiáng)度和彈性方面起作用。在強(qiáng)度特殊的肌肉中，如心肌，PEVK區(qū)的長(zhǎng)度只有163個(gè)殘基，而在彈性大的骨骼肌中PEVK區(qū)超過2000個(gè)殘基。,肌連蛋白的功能

45、,在肌纖維中肌連蛋白形成長(zhǎng)而柔軟的細(xì)絲，一個(gè)這樣的細(xì)絲，在松弛狀態(tài)下長(zhǎng)1000nm，在張力下它能伸長(zhǎng)到3000nm以上。在肌肉中肌連蛋白從M線的邊緣開始，沿肌球蛋白絲全長(zhǎng)伸展至Z盤。在這里肌連蛋白的作用可能是把肌球蛋白連接到Z盤上，以及作為“分子尺”調(diào)節(jié)肌節(jié)的長(zhǎng)度，防止肌肉過分伸張。當(dāng)肌原纖維伸張超過粗、細(xì)絲的重疊部分，肌連蛋白則被動(dòng)產(chǎn)生張力，使肌原纖維復(fù)原。,細(xì)胞器沿微管的運(yùn)動(dòng),,Kinesin驅(qū)動(dòng)蛋白,Dynein動(dòng)力蛋白,六、