王鏡巖生物化學(xué)氨基酸與蛋白質(zhì)

1、2024/3/14,1,第三章 蛋白質(zhì),2024/3/14,2,蛋白質(zhì)是由20種L-型α氨基酸組成的長(zhǎng)鏈分子。,第一節(jié)         蛋白質(zhì)概論,一、  蛋白質(zhì)的化學(xué)組成與分類,1、元素組成,碳 50% 氫7% 氧23% 氮16% 硫 0-3% 微量的磷、鐵、銅、碘、鋅、鉬,凱氏定氮：粗蛋白質(zhì)含

2、量=蛋白氮×6.25,2、 氨基酸組成,2024/3/14,3,酶、運(yùn)輸?shù)鞍住I(yíng)養(yǎng)和貯存蛋白、激素、受體蛋白、運(yùn)動(dòng)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、防御蛋白。,3、分類,（1） 按組成,簡(jiǎn)單蛋白 結(jié)合蛋白,（2）按分子外形的對(duì)稱程度,球狀蛋白質(zhì) 纖維狀蛋白質(zhì) 膜蛋白質(zhì),（3）按功能,2024/3/14,4,蛋白質(zhì)分子量 = 氨基酸數(shù)目*110,二、蛋白質(zhì)的大小與形狀,少于50個(gè)氨基酸的低分子量氨基酸多聚物稱為肽，寡肽或生物

3、活性肽、多肽。,多于50個(gè)氨基酸的稱為蛋白質(zhì)。,110=氨基酸殘基的平均分子量（P160）,2024/3/14,5,四級(jí)結(jié)構(gòu)：亞基之間的聚集形式,三、蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象與結(jié)構(gòu)層次,蛋白質(zhì)都有自己特有的天然空間結(jié)構(gòu)，稱為構(gòu)象。,一級(jí)結(jié)構(gòu)：氨基酸順序,二級(jí)結(jié)構(gòu)：α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角，無(wú)規(guī)卷曲,三級(jí)結(jié)構(gòu)：整個(gè)肽鏈（亞基）的形狀,2024/3/14,6,1． 酶 2．結(jié)構(gòu)成分（結(jié)締組織的膠原蛋白、血管和皮膚的彈性蛋白、膜蛋白）3．貯藏

4、（卵清蛋白、種子蛋白）4．物質(zhì)運(yùn)輸（血紅蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖運(yùn)輸載體、脂蛋白、電子傳遞體）5．細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（肌肉收縮的肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白）6．激素功能（胰島素）7．自我保護(hù)（抗體、皮膚的角蛋白、血凝蛋白8．接受、傳遞信息（受體蛋白，味覺蛋白）9．調(diào)節(jié)、控制細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、和遺傳信息的表達(dá)（組蛋白、阻遏蛋白）,四、  蛋白質(zhì)功能的多樣性,2024/3/14,7,第二節(jié)   

5、;        氨基酸,四大類生物分子中，蛋白質(zhì)是生物功能的主要載體，而氨基酸是蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子。,自然界中存在的成千上萬(wàn)種蛋白質(zhì)，在結(jié)構(gòu)和功能上的驚人的多樣性歸根結(jié)底是由20中常見的氨基酸的內(nèi)在性質(zhì)造成的。,這些性質(zhì)包括：,聚合能力,酸堿性,側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的多樣性,化學(xué)功能的多樣性,2024/3/14,8,一、蛋白質(zhì)的水解,酸水解：色氨酸破壞，天冬酰胺、谷胺酰胺脫酰胺基

6、,堿水解：消旋，色氨酸穩(wěn)定,酶水解：水解位點(diǎn)特異，用于一級(jí)結(jié)構(gòu)分析，肽譜,2024/3/14,9,非蛋白質(zhì)氨基酸：存在于生物體內(nèi)但不組成蛋白質(zhì) (約150種),二、氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類,基本氨基酸（編碼的蛋白質(zhì)氨基酸）：組成蛋白質(zhì)，20種,稀有氨基酸：是多肽合成后由基本氨基酸經(jīng)酶促修飾而來(lái),重點(diǎn),2024/3/14,10,,α-氨基酸的一般結(jié)構(gòu),α-氨基酸,與羧基相鄰的α-碳原子（Cα）上有一個(gè)氨基的氨基酸。,COO-,-Cα-,R,,,

7、H3N,可變的側(cè)鏈,H,2024/3/14,11,（1）R為脂肪烴基的氨基酸（5種）,（一）基本氨基酸（編碼的蛋白質(zhì)氨基酸，20種）,1、按照R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類,,,,,,,,,,,,,,,,2024/3/14,12,Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性 從Gly至Ile，R基團(tuán)疏水性增加,特點(diǎn),R基均為中性烷基，R基對(duì)分子酸堿性影響很小，它們幾乎有相同的等電點(diǎn)。（6 .0±0.03）,2024/3/14,13

8、,（2） R中含有羥基和硫的氨基酸（共4種）,,,,,,,,2024/3/14,14,★ Ser的-CH2OH基（pKa=15）在生理?xiàng)l件下不解離，但在大多數(shù)酶的活性中心都發(fā)現(xiàn)有Ser殘基存在。★ Ser和Thr的-OH往往與糖鏈相連，形成糖蛋白。 ★ Cys的R中含巰基（-SH），具有兩個(gè)重要性質(zhì)： （1）在較高pH值條件，巰基離解。 （2）兩個(gè)Cys的巰基氧化生

9、成二硫鍵，生成胱氨酸?！?Met在生物合成中是一種重要的甲基供體。,特點(diǎn),2024/3/14,15,（3）R中含有酰胺基團(tuán)（2種）,酰胺基中氨基易發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng),,,2024/3/14,16,（4）R中含有酸性基團(tuán)（2種） Asp、Glu,Asp側(cè)鏈羧基pKa為3.86，Glu側(cè)鏈羧基pKa為4.25 它們是唯一在生理?xiàng)l件下帶有負(fù)電荷的的兩個(gè) 氨基酸,,,2024/3/14,17,（5）R中含堿性基團(tuán)（3

10、種）,,,,,,2024/3/14,18,★ Lys側(cè)鏈氨基的pKa為10.53，生理?xiàng)l件下，Lys側(cè)鏈帶有一個(gè)正電荷（—NH3+），側(cè)鏈的氨基反應(yīng)活性增大。 ★ Arg是堿性最強(qiáng)的氨基酸，側(cè)鏈上的胍基是已知堿性最強(qiáng)的有機(jī)堿，pKa值為12.48，生理?xiàng)l件下完全質(zhì)子化。 ★ His是pKa值最接近生理pH值的一種（游離氨基酸中為6.00，在多肽鏈中為7.35 ） ，是在生理pH條件下唯一具有緩沖能力的氨基酸。

11、★ His在酶的酸堿催化機(jī)制中起重要作用,特點(diǎn),2024/3/14,19,在280nm處，Trp吸收最強(qiáng)，Tyr次之，Phe最弱。,（6） 芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）,苯丙氨酸（Phe,F）,酪氨酸（Tyr,Y）,色氨酸（Trp,W）,2024/3/14,20,（7）、雜環(huán)族氨基酸（2種）,Pro的α-亞氨基是環(huán)的一部分，因此具有特殊的剛性結(jié)構(gòu)。一般出現(xiàn)在兩段α-螺旋之間的轉(zhuǎn)角處，Pro殘基所在的位置必然發(fā)

12、生骨架方向的變化，,2024/3/14,21,嬰兒期：Arg（精氨酸）和His（組氨酸）供給不足， 屬半必需氨基酸。,u必需氨基酸u,成年人：Thr 蘇氨酸 Val 纈氨酸 Leu 亮氨酸 Ile 異亮氨酸 Phe 苯丙氨酸

13、 Trp 色氨酸 Lys 賴氨酸 Met 甲硫氨酸,攜（纈氨酸）一（異亮氨酸）兩（亮氨酸）本（苯丙氨酸）單（蛋氨酸，即甲硫氨酸）色（色氨酸）書（蘇氨酸）來(lái)（賴氨酸）。 攜（寫）一兩本單色書來(lái)；一兩色素本來(lái)淡些；假設(shè)來(lái)寫一兩本書,,（一） 賴氨酸（Lysine ）：促進(jìn)大腦發(fā)育，是肝及膽的組成成分，能促進(jìn)脂肪代謝，調(diào)節(jié)松果腺、乳腺、黃體

14、及卵巢，防止細(xì)胞退化； （二） 色氨酸（Tryptophane）：促進(jìn)胃液及胰液的產(chǎn)生； （三） 苯丙氨酸（Phenylalanine）：參與消除腎及膀胱功能的損耗；  （四） 蛋氨酸（又叫甲硫氨酸）（Methionine）；參與組成血紅蛋白、組織與血清，有促進(jìn)脾臟、胰臟及淋巴的功能； （五） 蘇氨酸（Threonine）：有轉(zhuǎn)變某些氨基酸

15、達(dá)到平衡的功能；  （六） 異亮氨酸（Isoleucine ）：參與胸腺、脾臟及腦下腺的調(diào)節(jié)以及代謝；腦下腺屬總司令部作用于甲狀腺、性腺；  （七） 亮氨酸（Leucine ）：作用平衡異亮氨酸； （八） 纈氨酸（Viline）：作用于黃體、乳腺及卵巢。 （九） 組氨酸（Hlstidine）：作用于代謝的調(diào)節(jié)；

16、,2024/3/14,22,2024/3/14,23,在維持蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中起著重要（蛋白質(zhì)的疏水核心）。,（1）非極性氨基酸 9種,這類氨基酸的側(cè)鏈都能與水形成氫鍵，因此很容易溶于水,（2） 不帶電何的極性氨基酸 6種,（3）帶負(fù)電荷的氨基酸(酸性氨基酸) 2種,（4）帶正電荷的氨基酸(堿性氨基酸) 3種,2024/3/14,24,非極性氨基酸,在維持蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中起著重要作用（蛋白質(zhì)的

17、疏水核心）。,2024/3/14,25,2024/3/14,26,不帶電荷的極性氨基酸,這類氨基酸的側(cè)鏈都能與水形成氫鍵，因此很容易溶于水。,2024/3/14,27,帶負(fù)電荷的氨基酸(酸性氨基酸),2024/3/14,28,帶正電荷的氨基酸(堿性氨基酸),2024/3/14,29,膠原蛋白中的Lys側(cè)鏈氧化時(shí)能形成很強(qiáng)的分子間(內(nèi))交聯(lián)。,Arg的側(cè)鏈堿性很強(qiáng)，與NaOH相當(dāng)。,His是一個(gè)弱堿，是天然的緩沖劑，往往存在于許多酶的活性

18、中心。,非極性氨基酸一般形成蛋白質(zhì)的疏水核心，帶電荷的氨基酸和極性氨基酸位于表面。,酶的活性中心：His、Ser、Cys,2024/3/14,30,（二）  非編碼的蛋白質(zhì)氨基酸,也稱修飾氨基酸，是在蛋白質(zhì)合成后，由基本氨基酸修飾而來(lái)。,（1）4-羥脯氨酸 （2）5-羥賴氨酸 這兩種氨基酸主要存在于結(jié)締組織的纖維狀蛋白中。 （3）6-N-甲基賴氨酸 存在于肌球蛋白中 &#

19、160;（4）г-羧基谷氨酸 存在于凝血酶原及某些具有結(jié)合Ca2+離子功能的蛋白質(zhì)中。 （5）Tyr的衍生物：3.5 -二碘酪氨酸、甲狀腺素 存在于甲狀腺蛋白中（6）鎖鏈素由4個(gè)Lys組成 存在于彈性蛋白中,2024/3/14,31,,,2024/3/14,32,β-Ala（泛素的前體）、γ-氨基丁酸（神經(jīng)遞質(zhì)）,（三）  非蛋白質(zhì)氨基酸,不組成蛋白質(zhì)，但有生理功能的氨基酸

20、,L-瓜氨酸、L-鳥氨酸是尿素循環(huán)的中間物,1、L-型α –氨基酸的衍生物,2、D-型氨基酸,D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短桿菌肽S）,3、β-、γ-、δ-氨基酸,2024/3/14,33,,2024/3/14,35,精氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸是尿素循環(huán)的中間物。,三、氨基酸的功能,1、組成蛋白質(zhì),2、一些氨基酸及其衍生物充當(dāng)化學(xué)信號(hào)分子,?-氨基丁酸，色氨酸衍生物：5-羥色胺、褪黑激素，都是神經(jīng)遞質(zhì)。甲狀腺素（Tyr

21、衍生物），吲哚乙酸（Trp衍生物）都是激素,3、氨基酸是許多含N分子的前體物,核酸的含氮堿基、血紅素、葉綠素的合成都需要氨基酸。,4、一些基本氨基酸和非基本氨基酸是代謝中間物,2024/3/14,36,Gly（甘氨酸）只有一種構(gòu)型,無(wú)旋光性Thr（蘇氨酸）和Ile（異亮氨酸）有四種光學(xué)異構(gòu)體。其余17種氨基酸有兩種光學(xué)異構(gòu)體：L型、D型。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸均屬L-型。,四、氨基酸的構(gòu)型、旋光性和光吸收,1、  

22、; 氨基酸的構(gòu)型,2024/3/14,37,,,2024/3/14,38,L-蘇氨酸和D-蘇氨酸組成消旋物。L-別一蘇氨酸和D-別-蘇氨酸組成消旋物,2、   氨基酸的旋光性,★氨基酸的旋光性（符號(hào)和大?。┤Q于它的R基的性質(zhì)，并與溶液的pH值有關(guān)。,★　外消旋物：D-型和L-型的等摩爾混合物。,2024/3/14,39,胱氨酸有三種立體異構(gòu)體： L-胱氨酸、D-胱氨酸、內(nèi)消旋胱氨酸。

23、 L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物,★內(nèi)消旋物：分子內(nèi)消旋,2024/3/14,40,3、氨基酸的光吸收性,Tyr、Phe、Trp的R基含有共軛雙鍵，在220-300nm近紫外區(qū)有吸收。,p145,2024/3/14,41,五、  氨基酸的酸堿性質(zhì),1、氨基酸在晶體和水溶液中主要以兼性離子形式存在,2、氨基酸的兩性解離和酸堿滴定曲線,（1）pKa/ 就是氨基酸50%解離（[堿] = [酸]）時(shí)溶液的pH

24、值， Ka/就是此時(shí)溶液的[H+],（2）當(dāng)HA50%解離時(shí)，溶液的pH值等于pKa/,（3） pH = pKa/ 時(shí)，[堿] = [酸] （ 50%解離 ） pH > pKa/ 時(shí)，[堿] > [酸]（＞50%解離） pH [堿]（＜50%解離）,2024/3/14,42,甘氨酸的滴定曲線（解離曲線）,2024/3/14,43,起點(diǎn)：

25、 100% G+ 凈電荷：+1第一拐點(diǎn)： 50%G + ，50%G± 平均凈電荷：+0.5 pH=pK1+lg[G±]/[G+] = pK1 = 2.34第二拐點(diǎn)：0%G± 凈電荷：0 等電點(diǎn)pI=5.97第三拐點(diǎn)： 50%G± ，50%G- 平均凈電荷：-0.5 pH

26、=pK2+lg[G-]/[G±]=pK2=9.6終點(diǎn)： 100% G- 凈電荷：-1在pH2.34和pH9.60處，Gly具有緩沖能力。,2024/3/14,44,2024/3/14,45,,Gly等電點(diǎn)的計(jì)算,2024/3/14,46,,,2,2,),3,(,),3,(,),(,R,NH,NH,COOH,pK,pK,pI,pK,pK,pI,+,=,+,=,-,-,-,a,a,a,中性氨基酸,堿性氨基酸,酸性

27、氨基酸,氨基酸等電點(diǎn)的計(jì)算,2024/3/14,47,★ pH < pI時(shí)， -NH2解離成-NH3+，氨基酸帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)。,★ pH > pI時(shí)， -COOH解離成-COO-，氨基酸帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)作用下向正極移動(dòng)。,★ pH = pI時(shí)，氨基酸凈電荷為零，在電場(chǎng)中不移動(dòng),2024/3/14,48,六、  氨基酸的化學(xué)性質(zhì),+ HNO2,,+ N2↑,收集反應(yīng)放出的氮?dú)?，可用?lái)測(cè)定氨基酸的

28、含量，這種測(cè)定氨基酸含量的方法稱為范斯萊克（Van slyke）氨基測(cè)定法。,1、與亞硝酸反應(yīng),（一）α-NH2參加的反應(yīng),,,,2024/3/14,49,芐氧甲酰氯（carbobenzyloxychloride,Cbz-Cl) 叔丁氧甲酰氯 對(duì)-甲苯磺酰氯 鄰苯二甲酸酐,2、與?；噭┓磻?yīng),氨基酸的氨基與酰氯或酸酐在弱堿溶液中發(fā)生作用時(shí)，氨基即被?；?。,酰化試劑,★?；噭┰诙嚯牡娜斯ず铣芍斜挥米靼被?/p>

29、護(hù)劑。,P136,2024/3/14,50,（ DNS-氨基酸 ，黃色熒光）,★丹磺酰氯（DNS-Cl，5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯）常用于多肽鏈—NH2末端氨基酸的標(biāo)記和微量氨基酸的定量測(cè)定。,,,,2024/3/14,51,★Sanger 反應(yīng) （2，4一二硝基氟苯，DNFB） DNP-氨基酸被Sanger用來(lái)測(cè)定多肽的NH2末端氨基酸,3、   烴基化反應(yīng),（弱堿）,（黃

30、色）,,氨基酸氨基的一個(gè)H原子可被烴基（包括環(huán)烴及其衍生物）取代。,2024/3/14,52,苯異硫氰酸酯，PITC  苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-多肽）苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），無(wú)色，可以用層析法分離鑒定。被Edman用來(lái)鑒定多肽的NH2末端氨基酸,（弱堿）,（CH3NO2/H+）,★Edman反應(yīng),2024/3/14,53,,,甲醛,甲醛,西佛堿是某些酶促反應(yīng)的中間產(chǎn)物（如轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的中間產(chǎn)物）。

31、,4、生成西佛堿的反應(yīng)（Schiff）,氨基酸的α-氨基能與醛類化合物反應(yīng)生成弱堿（Schiff’s base）,,,2024/3/14,54,5、脫氨基反應(yīng),氨基酸在生物體內(nèi)經(jīng)氨基酸氧化酶催化即脫去α-氨基而轉(zhuǎn)變成酮酸。,,氨基酸氧化酶,,,2024/3/14,55,（二）α-羧基參加的反應(yīng),1、成鹽、成酯反應(yīng),可以屏蔽羧基活化氨基,+,C2H5OH,,干燥， HCl,回流,,R,CH,COOC2O5,NH3Cl-,,,,,+,+,H

32、2O,成酯反應(yīng),+,NaOH,,+,H2O,2024/3/14,56,,,氨基被保護(hù)后，羧基可與二氯亞砜或五氯化磷反應(yīng)，生成酰氯， 使羧基活化，在多肽的人工合成中常用。,2、成酰氯的反應(yīng),HN-保護(hù)基,R-CH-COOH,,+,PCl5,HN-保護(hù)基,R-CH-COOCl,,+,POCl3,,+,HCl,,,2024/3/14,57,,,,3、疊氮反應(yīng),活化羧基，可用于肽的人工合成。,?；被峒柞ィ╕=?；?,YNH O,R-CH

33、-C-NHNH2,,,,?；被狨ｋ?NH2NH2,,YNH O,R-CH-C-N-N=N,,,,,+,H2O,酰化氨基酸疊氮,2024/3/14,58,,,將?-氨基酸加熱時(shí)，可脫去CO2得到胺。,4、脫羧基反應(yīng),2024/3/14,59,茚三酮在弱酸中與α-氨基酸共熱，引起氨基酸的氧化脫氨，脫羧反應(yīng)，最后，茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物——氨和還原茚三酮反應(yīng)，生成紫色物質(zhì)（λmax=570nm）。,（三） α-NH2和α-COOH共同參加的反應(yīng)

34、,1、與茚三酮反應(yīng),,+,+ NH3CO2RCHOH+,+,+,,C,C,C,OH,O,,,,,,,,,,,,,,,,,,C,C,C,O,O,N,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,藍(lán)紫色復(fù)合物,Pro、Hy-Pro與直接形成黃色化合物（ λmax=440nm）,,茚三酮,還原茚三酮,還原茚三酮,茚三酮,（λmax=570nm）,2024/3/14,61,2、成肽反應(yīng),一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基可以縮合成肽，形成的鍵

35、稱肽鍵。,肽鍵,,,2024/3/14,62,（四）  側(cè)鏈R基參加的反應(yīng) ——用于蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾,略,,2024/3/14,63,（一）基于電荷性質(zhì)差異的分離方法,七、  氨基酸的分離和分析,Glu、Leu 、His 、Lys，4種混合樣，在pH6.0時(shí)，泳動(dòng)方向,1、電泳分離,電泳的基本原理,Glu Leu His

36、LyspI 3.22 5.98 7.59 9.74,,+,-,,,2024/3/14,64,2、   離子交換柱層析,磺酸型陽(yáng)離子交換樹脂,氨基酸與樹脂上解離基團(tuán)之間的靜電引力氨基酸與樹脂基質(zhì)聚苯乙烯之間的疏水作用,,,NH3-CH-COOH,R,,+,,2024/3/14,65,2024/3/14,66,2024/3/14,67,1、 紙層析,流動(dòng)相：丁醇、

37、醋酸、水,★基本步驟：點(diǎn)樣、展層、現(xiàn)色、定性（定量）,（二）基于分配系數(shù)（極性）差異的分離方法 ——分配層析,分配系數(shù)：在流動(dòng)相中分配系數(shù)越大，移動(dòng)越快。,固定相：吸附的水,逆流分溶原理,2024/3/14,68,2、薄層層析,★基本步驟：鋪板、點(diǎn)樣、展層、現(xiàn)色、定性（定量）,★支持劑：纖維素粉、 硅膠、 氧化鋁粉,2024/3/14,

38、69,3、分配柱層析,支持劑：纖維素、淀粉、硅膠固定相：吸附水流動(dòng)相；苯酚、正丁醇,2024/3/14,70,固定相：涂有薄層液體的惰性顆粒流動(dòng)相：H2、N2、CO2★前提：樣品能汽化、熱穩(wěn)定,（三）氣液層析（氣相層析、氣相色譜）,2024/3/14,71,分配層析離子交換層析吸附層析 凝膠過濾層析,（四）高效液相層析（HPLC）,2024/3/14,72,第三節(jié)     蛋白

39、質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu) （共價(jià)結(jié)構(gòu)）,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次,2024/3/14,73,蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序(含二硫鍵),一級(jí)結(jié)構(gòu)（共價(jià)結(jié)構(gòu)）,二級(jí)結(jié)構(gòu),多肽主鏈中各個(gè)肽段借助于相鄰氨基酸之間的氫鍵形成的構(gòu)象。主要有α-螺旋、β折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲。,超二級(jí)結(jié)構(gòu),由兩個(gè)以上二級(jí)結(jié)構(gòu)單元相互聚集形成的有規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)的組合體如αα、βαβ、βββ。,2024/3/14,74,2024/3/14,75,2024/3/

40、14,76,2024/3/14,77,2024/3/14,78,大的球蛋白分子中，多肽鏈形成幾個(gè)緊密的球狀構(gòu)象，彼此以松散的肽鏈相連，此球狀構(gòu)象是結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域是多肽鏈的獨(dú)立折疊單位，一般由100-200個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。,結(jié)構(gòu)域,2024/3/14,79,單鏈蛋白質(zhì)只有一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，無(wú)四級(jí)結(jié)構(gòu)。,三級(jí)結(jié)構(gòu),整條多肽鏈或亞基通過盤旋、折疊，形成緊密的、借各種次級(jí)鍵維持的球狀構(gòu)象。,四級(jí)結(jié)構(gòu),寡聚蛋白中亞基種類、數(shù)目、空間排布及亞基間

41、相互作用力。,2024/3/14,80,2024/3/14,81,2024/3/14,82,酰胺平面，肽單位間以α-C原子相隔，構(gòu)成肽鏈。,一、肽和肽鍵的結(jié)構(gòu),肽,一個(gè)氨基酸的羧基和另一個(gè)氨基酸的氨基脫水縮合而成的化合物。其中的氨基酸單位稱氨基酸殘基。,肽鍵,氨基酸間脫水后形成的共價(jià)鍵稱肽鍵（酰氨鍵）。,肽單位,2024/3/14,83,五 肽 名稱：絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸寫法： Ｎ Ser-Gly--Try-

42、Ala---Leu或ＳＧＹＡＬ，,,,,,2024/3/14,84,肽鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。肽鍵具有平面性，組成肽鍵的4個(gè)原子和2個(gè)Cα幾乎處在同一平面內(nèi)（酰氨平面）。肽鍵亞氨基在pH0---14內(nèi)不解離。,★肽鍵的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),2024/3/14,85,★多肽鏈可以看成由Cα串聯(lián)起來(lái)的無(wú)數(shù)個(gè)酰胺平面組成,2024/3/14,86,短肽在晶體和水溶液中也是以偶極離子形式存在。 肽的酸堿性質(zhì)主要取

43、決于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－COOH以及側(cè)鏈Ｒ上可解離的基團(tuán)。 在長(zhǎng)肽或蛋白質(zhì)中，可解離的基團(tuán)主要是側(cè)鏈基團(tuán)。,二、肽的重要性質(zhì),1、旋光性,一般短肽的旋光度等于其各個(gè)氨基酸的旋光度的總和。,2、 肽的酸堿性質(zhì),2024/3/14,87,雙縮脲反應(yīng)是肽和蛋白質(zhì)特有的反應(yīng)，游離氨基酸無(wú)此反應(yīng)。,3、肽的化學(xué)反應(yīng),肽的α-羧基，α-氨基和側(cè)鏈R基上的活性基團(tuán)都能發(fā)生與游離氨基酸相似的反應(yīng)。,★雙縮脲反應(yīng),凡是有肽鍵結(jié)構(gòu)的化合

44、物都會(huì)發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，可用于定量分析。,H2N-CO-NH-CO-NH2,雙縮脲,CuSO4-NaOH,,,紫紅色化合物,,,2024/3/14,88,★紅細(xì)胞中的巰基緩沖劑。 ☆參與氧化還原過程，清除內(nèi)源性過氧化物和自由基，維護(hù)蛋白質(zhì)活性中心的巰基處于還原狀態(tài)。,三、天然存在的活性肽,1、谷胱甘肽 Glu—Cys—Gly,2024/3/14,89,由短桿菌產(chǎn)生的10肽環(huán)?？垢锾m氏陽(yáng)性細(xì)菌，臨床用于治療

45、化濃性病癥。,2、   短桿菌肽（抗生素）,2024/3/14,90,① 合成蛋白質(zhì)的剪切、修飾② 酶專一性逐步合成（如谷胱甘肽）、③ 動(dòng)物腸道可吸收寡肽,3、   腦啡肽（5肽）,Met--- 腦啡肽： Tyr—Gly—Gly—Phe—Met Leu----腦啡肽： Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu

46、 具有鎮(zhèn)痛作用。,生物體內(nèi)寡肽的來(lái)源,2024/3/14,91,4、肽類激素,2024/3/14,92,四、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定,（一） 蛋白質(zhì)測(cè)序的基本策略,對(duì)于一個(gè)純蛋白質(zhì)，理想方法是從N端直接測(cè)至C端，但目前只能測(cè)60個(gè)N端氨基酸。,1、直接法（測(cè)蛋白質(zhì)的序列）,2、間接法（測(cè)核酸序列推斷氨基酸序列）,2024/3/14,93,（1）    測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目（2） &

47、#160;  拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈。（3）   斷裂鏈內(nèi)二硫鍵。（4） 分析多肽鏈的N末端和C末端。 （5）    測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成。（6）    多肽鏈部分裂解成肽段。（7）    測(cè)定各個(gè)肽段的氨基酸順序（8）    確定肽段在多肽鏈中的順序。（9

48、）    確定多肽鏈中二硫鍵的位置。,（二）蛋白質(zhì)測(cè)序的一般步驟,2024/3/14,94,估算氨基酸殘基數(shù)，確定肽鏈數(shù) 方法： SDS-PAGE 凝膠過濾法 沉降系數(shù)法,（三） 測(cè)序前的準(zhǔn)備工作,1、   蛋白質(zhì)的純度鑒定,要求：純度97%以上，均一。鑒定方法： ⑴聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)要求一條帶。

49、 ⑵DNS—Cl（二甲氨基萘磺酰氯）法測(cè)N端氨基酸。,2、測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量,2024/3/14,95,酸水解的同時(shí)輔以堿水解。確定肽鏈中各種氨基酸出現(xiàn)的頻率,便于選擇裂解方法及試劑。,3、   確定亞基種類及數(shù)目,根據(jù)分子量和N末端數(shù),4、拆分多肽鏈，分別分離純化,⑴非共價(jià)鍵結(jié)合： 8mol/L尿素， SDS-PAGE⑵二硫鍵結(jié)合： 過甲酸氧化：

50、—S—S— + HCOOOH → SO3H β巰基乙醇還原,5、   測(cè)定氨基酸組成,2024/3/14,96,6、端基分析,N端分析,★DNS-Cl法,最常用，黃色熒光，靈敏度極高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。,★DNFB法,Sanger試劑，DNP-多肽，酸水解，黃色DNP-氨基酸，有機(jī)溶劑（乙酸乙酯）抽提分離，紙層析、薄層層析、液相等,★ PITC法,Edman法，逐步切

51、下。無(wú)色PTH-氨基酸，有機(jī)溶劑抽提，層析,2024/3/14,97,無(wú)水肼NH2NH2 100℃ 5-10h。 苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游離氨基酸留在上清中。Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。,C端分析,★肼解法,,2024/3/14,98,羧肽酶A： 除Pro、Arg、Lys外的所有C端氨基酸羧肽酶B： 只水解Arg、Lys,羧肽酶法測(cè)C末端,★羧

52、肽酶法（Pro不能測(cè)）,2024/3/14,99,①溴化氰 —Met—X— 產(chǎn)率85% ②亞碘?；郊姿?—Trp—X— 產(chǎn)率70-100% ③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸） —X—Cys— ④羥胺NH2OH

53、 —Asn—Gly— 約150個(gè)氨基酸出現(xiàn)一次,（四） 肽鏈的部分裂解和肽段的分離純化,1、化學(xué)裂解法,2024/3/14,100,胰蛋白酶 Lys——X (X ≠ Pro) Arg—— X 胰凝乳蛋白酶 Tyr——X (X ≠ Pro)

54、 Trp——X Phe——X胃蛋白酶 Phe(Trp、 Try、 Leu)——Phe(Trp、 Try、 Leu)Glu蛋白酶 Glu——X （Vs蛋白酶）Arg蛋白酶 Arg——XLys蛋白酶 X——LysPro蛋白酶 Pro——X,2、酶法裂解,2024/3/

55、14,101,① 電泳法 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 根據(jù)分子量大小分離② 離子交換層析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex） 根據(jù)肽段的電荷特性分離③ 反相ＨＰＬＣ法 根據(jù)肽段的極性分離凝膠過濾 根據(jù)肽段的大小分離,3、肽段的分離純化,要求： ＳＤＳ－ＰＡＧＥ單帶

56、 ＨＰＬＣ單峰 Ｎ端單一（常用ＤＮＳ－C l法）,2024/3/14,102,（1）耦聯(lián) PITC ＋ H２N—A-B-C-D pH8—9，40℃ PTC——A-B-C-D（2）裂解 無(wú)水三氟乙酸（TFA） ATZ—A + H2N—B-C-D（3）轉(zhuǎn)化 PTH—A PTC肽：苯氨基硫甲酰肽

57、ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）PTH：苯乙內(nèi)酰硫脲（一氨基酸）,（五） 肽段序列測(cè)定及肽鏈的拼接,1、 Edman法,2024/3/14,103,熒光基-團(tuán)或有色試劑標(biāo)記的PITC試劑。4-N、N-二甲基氨基偶氮苯-4’異硫氰酸酯。,2、DNS-Edman法,用DNS法測(cè)N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。,3、有色 Edman法,2024/3/14,104,儀器原理：Edman法。1967液相測(cè)序儀

58、 自旋反應(yīng)器，適于大肽段。1971固相測(cè)序儀表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦連肽段的Ｃ端。1981氣相測(cè)序儀 用Polybrene反應(yīng)器。 （聚陽(yáng)離子）四級(jí)銨鹽聚合物 液相：5nmol 20-40肽 97% 氣相：5pmol 60 肽 98%,4、用自動(dòng)序列分析儀測(cè)序,2024/3/14,105,16肽，Ｎ端H Ｃ端Ｓ

59、 Ａ法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT Ｂ法裂解：SEO WTON VERL APS HO重疊法確定序列：HOWTONSEOVER LAPS,5、肽段拼接成肽鏈,2024/3/14,106,2024/3/14,107,2024/3/14,108,①碘乙酰胺封閉-SH②胃蛋白酶酶解蛋白質(zhì)③第一向電泳④過甲酸氧化—S—S—生成-SO3H⑤第二向電泳⑥分離出含二硫鍵的

60、兩條短肽，測(cè)序⑦與拼接出的肽鏈比較，定出二硫鍵的位置。,（六）二硫鍵、酰胺及其他修飾基團(tuán)的確定,1、二硫鍵的確定（對(duì)角線電泳法）,方法,2024/3/14,109,★Asp –Asn、Glu-Gln 酶解肽鏈，產(chǎn)生含單個(gè)Asx或Glx的肽，用電泳法確定是Asp還是Asn★L(fēng)eu-Glx-Pro-Val肽 在pH=6.0 時(shí)，電荷量是 Leu+ Pro0 Val- 此

61、肽除Glx外，凈電荷為0，可根據(jù)此肽的電泳行為確定是Glu或是Gln。,2、酰胺的確定,舉例,2024/3/14,110,Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)Lys(Arg) –Ala-Ser(PO4),3、糖、脂、磷酸基位置的確定,糖 類,通過Asn、Ser與蛋白質(zhì)連接，-N-糖苷 -0-糖苷,脂 類,Ser、 Thr、Cys,磷 酸,Ser、 Thr、His,經(jīng)驗(yàn)性序列,2

62、024/3/14,111,★牛胰RNase變性一復(fù)性實(shí)驗(yàn),五、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物功能,（一） 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能,用(8M尿素+β硫基乙醇)變性、失活透析后構(gòu)象恢復(fù)，活性恢復(fù)95%以上。,牛胰RNase,共有124個(gè)氨基酸殘基 4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。 分子量：12600,,p181,2024/3/14,112,,,2024/3/14,113,血紅蛋白在不同的脊椎動(dòng)物中都具有輸送氧氣的功能細(xì)胞色素在所有的

63、生物中都是電子傳遞鏈的組分。,（二） 同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與生物進(jìn)化,同源蛋白質(zhì),在不同的生物體內(nèi)行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。,,例,2024/3/14,114,①同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性（序列同源性）②有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來(lái)說都是相同的，稱不變殘基，不變殘基高度保守，是必需的。 除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對(duì)不同的種屬有很大變化，稱可變殘基，可變殘基中，個(gè)別氨基酸的變化不

64、影響蛋白質(zhì)的功能。③多肽鏈長(zhǎng)度相同或相近,同源蛋白質(zhì)的特點(diǎn),2024/3/14,115,親源關(guān)系越遠(yuǎn)，同源蛋白的氨基酸順序差異就越大。,通過比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關(guān)系和進(jìn)化。,2024/3/14,116,分子量：12,500左右氨基酸殘基：100個(gè)左右，單鏈。25種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基35個(gè)。60種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基27個(gè)。親源關(guān)系越近的，其細(xì)胞色素C的差異越小。親源關(guān)系

65、越遠(yuǎn)的，其細(xì)胞色素C的差異越大。人與黑猩猩 0人與猴 1人與狗 10人與酵母 44,1、細(xì)胞色素C,2024/3/14,117,●有24個(gè)氨基酸殘基位置始終不變：A．B鏈上6個(gè)Cys 不變，其余18個(gè)氨基酸多數(shù)為非極性側(cè)鏈，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)起重要作用?！衿渌勺儼被釋?duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)作用不大，但對(duì)免疫反應(yīng)起作用?！褙i

66、與人接近，而狗則與人不同，因此可用豬的胰島素治療人的糖尿病。,2、胰島素,2024/3/14,118,2024/3/14,119,鐮刀形紅細(xì)胞貧血現(xiàn)是由于血紅蛋白發(fā)生了遺傳突變引起的?鏈第6位的aa線基由正常的Glu變成了疏水性的Val。 正常人血紅蛋白 β.N......Glu 6鐮刀型貧血 β.N......Val 6生理?xiàng)l件下電荷： Glu- Va10

67、 親水 疏水,（三） 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的突變------分子病,分子病,基因突變引起的某個(gè)功能蛋白的某一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了遺傳性替代從而導(dǎo)致整個(gè)分子的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，功能部分或全部喪失。,,例,2024/3/14,120,2024/3/14,121,2024/3/14,122,,,,,,（四） 一級(jí)結(jié)構(gòu)的部分切除與蛋白質(zhì)的激活,1、   血液凝固的機(jī)理,凝血因子（凝血酶原致活因

68、子）,凝血酶原,凝血酶,血纖維蛋白原,血纖維蛋白,血纖維蛋白凝塊,2024/3/14,123,（1）凝血酶原,在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274—Thr275、Arg323—Ile324斷裂，產(chǎn)生活性凝血酶。 A鏈49 氨基酸 B鏈259 氨基酸,2024/3/14,124,（2） 血纖維蛋白原,從二條α鏈和二條β鏈的N端各斷裂一個(gè)特定的肽鍵-Arg—Gly-，釋放出

69、二個(gè)纖維肽A（19個(gè)氨基酸）和二個(gè)纖維肽B（21個(gè)氨基酸），它們含有較多的酸性氨基酸殘基。,2024/3/14,125,A、B肽切除后，減少了蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷，促進(jìn)分子間聚集，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 在凝血因子XIIIa（纖維蛋白穩(wěn)定因子）催化下，纖維蛋白質(zhì)單體間形成共價(jià)?。℅ln-Lys結(jié)合），生成交聯(lián)的纖維蛋白。,2024/3/14,126,2、胰島素原的激活,前胰島素原（含信號(hào)肽）,胰島素原,活性胰島素,,,（在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上信

70、號(hào)肽被信號(hào)肽酶切除）,（在高爾基體上切除C肽）,2024/3/14,127,胰島素原,活性胰島素,2024/3/14,128,,,2024/3/14,129,從理論上講，一個(gè)多肽主鏈能有無(wú)限多種構(gòu)象。但是，只有一種或很少幾種天然構(gòu)象，且相當(dāng)穩(wěn)定。因?yàn)椋禾烊坏鞍踪|(zhì)主鏈上的單鍵并不能自由旋轉(zhuǎn)。,第四節(jié) 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和纖維狀蛋白質(zhì),一、多肽主鏈折疊的空間限制,2024/3/14,130,1、   肽鏈的二面角,

71、★環(huán)繞Cα—N鍵旋轉(zhuǎn)的角度為Φ 　環(huán)繞Cα—C鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱Ψ,★只有α碳原子連接的兩個(gè)鍵（Cα—N和Cα-C）是單鍵，能自由旋轉(zhuǎn)。,2024/3/14,131,★從Cα沿鍵軸方向看，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)的Φ (Ψ)角為正值，反之為負(fù)值。,★當(dāng)Φ(Ψ)旋轉(zhuǎn)鍵兩側(cè)的主鏈呈順式時(shí)，規(guī)定Φ(Ψ) =0°,2024/3/14,132,Φ和Ψ同時(shí)為0的構(gòu)象實(shí)際不存在二面角（Φ、Ψ）所決定的構(gòu)象能否存在，主要取決于兩個(gè)相鄰肽單位中非鍵合原子間