大學生物化學之 蛋白質(zhì)ppt課件

1、蛋白質(zhì)概述,一、蛋白質(zhì)的化學組成與分類二、蛋白質(zhì)的形狀、大小和分子量三、蛋白質(zhì)功能的多樣性,蛋白質(zhì)的化學組成與分類,1.元素組成：蛋白質(zhì)是一類含氮有機化合物，除含有碳、氫、氧外，還有氮和少量的硫。某些蛋白質(zhì)還含有其他一些元素，主要是磷、鐵、碘、鉬、鋅和銅等。這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為： 碳 50％-55% 氫 6.5-7.3％ 氧 19-24％

2、 氮 16% 硫 0-3％ 其他 微 量,蛋白質(zhì)的含氮量,大多數(shù)蛋白質(zhì)的含氮量接近于16%，這是蛋白質(zhì)元素組成的一個特點，也是凱氏（Kjedahl）定氮法測定蛋白質(zhì)含量的計算基礎。所以，可以根據(jù)生物樣品中的含氮量來計算蛋白質(zhì)的大概含量：樣品中蛋白質(zhì)含量=蛋白氮 ? 6.256.25為蛋白質(zhì)系數(shù)，即1克氮所代表的蛋白質(zhì)量（克數(shù)）,蛋白質(zhì)的分類,一、按化學組成分1、單純蛋白：

3、只含蛋白成分2、綴合蛋白：蛋白+輔基,單純蛋白,單純蛋白只含由?-氨基酸組成的肽鏈，不含其它成分。1，清蛋白和球蛋白：albumin and globulin廣泛存在于動物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。2，谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于70－80％乙醇中。3，精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質(zhì)，存在與細胞核中。4，硬蛋白：存在于各種

4、軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。,由單純蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而成。1、色蛋白：由簡單蛋白與色素物質(zhì)結(jié)合而成。如血紅蛋白、葉綠蛋白和細胞色素等。2、糖蛋白：由簡單蛋白與糖類物質(zhì)組成。如細胞膜中的糖蛋白等。3、脂蛋白：由簡單蛋白與脂類結(jié)合而成。 如血清?-，?-脂蛋白等。4、核蛋白：由簡單蛋白與核酸結(jié)合而成。如細胞核中的核糖核蛋白等。,綴合蛋白,,,按形狀和溶解度可將蛋白質(zhì)分為：1、纖維蛋

5、白2、球狀蛋白3、膜蛋白按肽鏈構(gòu)成分1、單體蛋白 2、寡聚蛋白或多聚蛋白,蛋白質(zhì)分子量的變化范圍很大，從大約6000到1000000道爾頓（Da）或更大。某些蛋白質(zhì)是由兩個或更多個蛋白質(zhì)亞基(多肽鏈)通過非共價結(jié)合而成的，稱寡聚蛋白質(zhì)。有些寡聚蛋白質(zhì)的分子量可高達數(shù)百萬甚至數(shù)千萬。（TMV：4x107）,1 D = 1.66033 ?10-27 Kg對于只含有多肽鏈的簡單蛋白質(zhì)：氨基酸殘基的數(shù)目=蛋白質(zhì)的

6、分子量 / 110 （氨基酸殘基平均分子量 110）,John Dalton,三、蛋白質(zhì)功能的多樣性,催化調(diào)節(jié)受體轉(zhuǎn)運貯存運動結(jié)構(gòu)成分 防御異常功能,催化代謝反應。這是蛋白質(zhì)的一個最重要的生物學功能,調(diào)節(jié)蛋白參與基因表達的調(diào)控。它們激活或抑制遺傳信息轉(zhuǎn)錄為RNA激素參與代謝調(diào)節(jié),催化調(diào)節(jié)受體轉(zhuǎn)運貯存運動結(jié)構(gòu)成分 防御異常功能,催化調(diào)節(jié)受體轉(zhuǎn)運貯存運動結(jié)構(gòu)成分 防御異常功能,受

7、體蛋白起接受和傳遞信息的作用。,催化調(diào)節(jié)受體轉(zhuǎn)運貯存運動結(jié)構(gòu)成分 防御異常功能,某些蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)運功能，攜帶各種小分子、離子等從一處到另一處。,有些蛋白質(zhì)有貯藏氨基酸的作用，用作有機體生長發(fā)育的氮源。如蛋類中的卵清蛋白為鳥類胚胎發(fā)育提供氮素小麥種子中的醇溶蛋白為種子發(fā)芽提供氮素。,催化調(diào)節(jié)受體轉(zhuǎn)運貯存運動結(jié)構(gòu)成分 防御異常功能,催化調(diào)節(jié)受體轉(zhuǎn)運貯存運動結(jié)構(gòu)成分 防御異常功能,人和動物的

8、運動，靠肌肉的收縮來實現(xiàn)，參與肌肉收縮的主要成分是肌球和肌動蛋白，沒有肌球蛋白和肌動蛋白，就沒有人和動物的運動。,,構(gòu)建和維持生物體的結(jié)構(gòu)，這類蛋白稱為結(jié)構(gòu)蛋白。細胞的片層結(jié)構(gòu)，如細胞膜、線粒體膜、葉綠體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等都是由不溶性蛋白與脂類組成的。在高等動物里，膠原蛋白參與結(jié)締組織和骨骼的形成，作為身體的支架。 動物的毛發(fā)和指甲都是由角蛋白構(gòu)成的。,催化調(diào)節(jié)受體轉(zhuǎn)運貯存運動結(jié)構(gòu)成分 防御異常功能,,,有些蛋白質(zhì)具有

9、主動的防護功能，抵抗外界不利因素對生物體的干擾。如脊椎動物體內(nèi)的免疫球蛋白（抗體），能中和外來有害物質(zhì)（抗原）?？箖龅鞍祝耗蠘O水域中某些魚類血液中含有，保護血液不被凍凝。蛇毒和蜂毒的溶血蛋白和神經(jīng)毒蛋白以及一些植物毒蛋白（蓖麻蛋白）等少量可引起高等動物產(chǎn)生強烈毒性反應。,催化調(diào)節(jié)受體轉(zhuǎn)運貯存運動結(jié)構(gòu)成分 防御異常功能,,應樂果甜蛋白有著極高的甜度，作甜味劑。某些海洋生物如貝類，分泌一類膠質(zhì)蛋白，能將貝殼牢固地粘在

10、巖石或其他硬表面上,催化調(diào)節(jié)受體轉(zhuǎn)運貯存運動結(jié)構(gòu)成分 防御異常功能,綜上所述：蛋白質(zhì)存在于所有的生物細胞中，是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。 蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎，它參與了幾乎所有的生命活動過程。,蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu),一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)二、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和纖維狀蛋白三、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)四、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈以特殊方式結(jié)合而成

11、的生物大分子。蛋白質(zhì)與多肽并無嚴格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。,蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),1. 定義—— 1969年，國際純化學與應用化學委員會（IUPAC） 規(guī)定：蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多肽連中AA的排列順序，包括二硫鍵的位置。其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎。,胰島素（insulin ）的一級結(jié)構(gòu)：,胰島素的分子量為5734道爾頓，由51個氨基酸組成。含A、B兩條鏈，（A鏈

12、：21肽 ，B鏈：30肽）。,A鏈和B鏈之間由兩個鏈間二硫鍵（A7-B7,A20-B19)連接，A鏈本身第6位和第11位的2個Cys殘基之間形成一個鏈內(nèi)二硫鍵。,胰島素是動物胰臟β細胞分泌的一種分子量較小的激素蛋白，主要功能是降低體內(nèi)血糖含量。,肽（peptide）,一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。,一、肽與肽鍵,由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成多

13、肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。,肽鍵（peptide bond）：,,0.127nm鍵長=0.132nm 0.148nm,肽平面：構(gòu)成肽鍵的四個原子（C、O、N、H）和與之相連的兩個α碳原子都處在同一個平面內(nèi)，此剛性結(jié)構(gòu)的平面稱肽平面或酰氨平面。,肽鍵的特點是氮原子上的孤對電子與羰基具有明顯的共軛作用。肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。,肽鍵,肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。在大多數(shù)情況下，以

14、反式結(jié)構(gòu)存在。,在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序通常在多肽鏈的一端含有一個游離的?-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個游離的?-羧基，稱為羧基端或C-端。氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點的排列順序。如上述五肽可表示為： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,二、肽鏈中AA的排列順序和命名,從肽鏈的N-末端開始，殘基用

15、酰稱呼。 例如：絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸, 簡寫：Ser-Gly--Tyr -- Ala -- Leu， 書寫時，通常把NH2末端AA殘基放在左邊，COOH末端AA殘基放在右邊。 共價主鏈：肽鏈的骨干是由--N --Cα --C --序列重復排列而成，稱為共價主鏈。,肽的命名,,,,四肽的結(jié)構(gòu),三、肽的重要理化性質(zhì),1.每種肽也有其晶體，晶體的熔點都很高。2.在pH0-14范圍內(nèi)，肽的酸堿性質(zhì)主要來自游離

16、末端?-NH2和游離末端?-COOH以及側(cè)鏈上可解離的基團。3.每一種肽都有其相應的等電點，計算方法與AA一致且復雜。 B2+,,B+,,B,,B-,,B2-,K?1,K?2,K?3,K?4,pI=pK’2+ pK’3/2,4. 肽的化學反應：也能發(fā)生茚三酮反應、 Sanger反應、DNS反應和Edman反應；還可發(fā)生雙縮脲反應。,,雙縮脲反應,含有兩個以上肽鍵的多肽，具有與雙縮脲相似的結(jié)構(gòu)特點，也能發(fā)

17、生雙縮脲反應，生成紫紅色或藍紫色絡合物。這是多肽定量測定的重要反應。,雙縮脲是兩分子的尿素經(jīng)加熱失去一分子NH3而得到的產(chǎn)物,肽和蛋白質(zhì)所特有而氨基酸所沒有的顏色反應,,四、 天然存在的重要多肽,在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽（active peptide）。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等

18、。,與真核生物的RNA聚合酶??和???牢固結(jié)合,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-腦啡肽 Leu-腦啡肽,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val ? ?

19、 L-Orn L-Orn ? ? L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu  短桿菌肽S(環(huán)十肽) 由細菌分泌的多肽，有時也都含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如鳥氨酸（Orn

20、ithine, 縮寫為 Orn）。,能抗革蘭氏陽性菌，對陰性細菌如綠膿桿菌、變性菌也有效。臨床上用于治療和預防化膿性病癥。,CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH,,CH2,,CH2,,CHNH2,,COOH,,CH2,,SH,?,?,?,2.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定,蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學研究的基礎。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)被測定。,測定蛋白質(zhì)氨基酸

21、順序的重要意義：,測定蛋白質(zhì)中的AA順序，是走向闡明其生物功能基礎中的很重要步驟。順序可以給出更多的信息。為了了解多肽鏈折疊成三維構(gòu)象所受到的限制，順序測定是必須的。AA順序的改變可以導致異常的功能和疾病，所以順序測定是分子病理學的一個重要部分。蛋白質(zhì)中的AA順序很能指明它的進化史。,a、樣品必需純（>97%以上）；b、知道蛋白質(zhì)的分子量；可以預測AA數(shù)目，工作量大小。c、知道蛋白質(zhì)由幾個亞基組成；,（1）測定蛋白質(zhì)一級

22、結(jié)構(gòu)的要求,(2) 測定步驟,A.測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目和種類。 通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。,蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定,B.多肽鏈的拆分。 由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進行拆分。,蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定,B.多肽鏈的拆分。 幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，

23、即可分開多肽鏈(亞基).尿素和鹽酸胍與蛋白質(zhì)的可能作用方式：a.與肽鏈競爭氫鍵b.增加非極性側(cè)鏈在 水中的溶解度,蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定,（NH）,脲或胍,,C.二硫鍵的斷裂 幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的?-巰基乙醇(還原法)處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑（ICH2COOH）保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。,蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定,SH-CH2-CH

24、2-OH,可以通過加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價力；應用過甲酸氧化法拆分多肽鏈間的二硫鍵。,蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定,,,,s,,s,,,,HcoooH,,,SO3H,SO3H,,,,,,S,,S,,,,S,,S,,,,S,,S,,胰島素,HO-CH2-CH2-SH,,,,,,,SH,SH,SH,SH,,,SH,SH,,,,,,,,,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C0

25、0H,ICH2COOH,,,還原保護,D.分析多肽鏈的N-末端和C-末端。多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定,N-端氨基酸分析：Sanger反應、Edman反應、與丹磺酰氯反應、氨肽酶法。C-端氨基酸分析：,又稱Sanger法。2,4-二硝基氟苯與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DN

26、P-蛋白質(zhì)）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進行鑒定。,N-末端基氨基酸測定,（1）二硝基氟苯（DNFB）法,丹磺酰氯（DNS）與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到DNS-蛋白質(zhì)，水解得DNS－氨基酸。此法的優(yōu)點是DNS-氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，不需提取可直接檢測，檢測靈敏度高。,N-末端基氨基酸測定,（2）丹磺酰氯法,（3） PITC法（ Edman 法）,N

27、-末端基氨基酸測定,氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個的向里水解。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應時間和氨基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。,N-末端基氨基酸測定,（4）氨肽酶法,此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化

28、物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。,肼解法,還原法,肽鏈 C－末端氨基酸可用硼氫化鋰還原成相應的氨基醇，再用層析法加以鑒定。Sanger早期就是采用這個方法鑒定胰島素A、B鏈的C－末端氨基酸,羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個的水解AA。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔

29、葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。,羧肽酶(carboxypeptidase)法,E.多肽鏈斷裂成多個肽段，可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。,,,,,,,,,多肽鏈斷裂法：酶解法和化學法,酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶等,Trypsin ：R1=Lys和Arg時

30、（專一性較強，水解速度快）。R2=Pro 水解受抑。,水解位點,胰蛋白酶,或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe, Trp,Tyr時水解快; R1= Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro 水解受抑。,肽鏈,水解位點,糜蛋白酶,Pepsin：R1和R2＝Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度較快。R1=Pro 水解受抑。,肽鏈,水解位點,胃蛋白酶,thermolysin：R2=Phe

31、, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性強的氨基酸水解速度較快。R2=Pro或Gly 水解受抑。R1或R3=Pro 水解受抑。,肽鏈,水解位點,嗜熱菌蛋白酶,谷氨酸蛋白酶： R1=Glu、Asp(磷酸緩沖液); R1=Glu (磷酸緩沖液或醋酸緩沖液)精氨酸蛋白酶： R1=Arg,肽鏈,水解位點,谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶,木瓜蛋白酶（R1=Arg,Gly\Ala\Leu\Glu\Asp）和彈性蛋白酶

32、(R1=Ala\Val\Gly\Ser),化學法：可獲得較大的肽段溴化氰(Cyanogen bromide)水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。,羥胺（NH2OH）：專一性斷裂-Asn-Gly-之間的肽鍵。也能部分裂解-Asn-Leu-之間的肽鍵以及-Asn-Ala-之間的肽鍵。,F.分離肽段測定每個肽段的氨基酸順序。,蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定,,,,,,,測定每條多肽鏈的氨基酸組成,Edman反應,2、氨肽酶法或羧肽酶

33、法,3、質(zhì)譜法（MS） 靈敏度高、所需樣品少、測定速度快,核糖體,蛋白質(zhì)鏈,4.根據(jù)核苷酸序列的推定法,G.確定肽段在多肽鏈中的次序。 利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。,H.確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。,,,,,,,,,,,,,采用胃蛋白酶水解：切點多，二硫鍵穩(wěn)定,一般采用胃蛋白酶處理含有二硫鍵的多肽鏈(切點多；酸性環(huán)境下防止二硫鍵發(fā)生交換)。將所得的肽段利用Br

34、own及Hartlay的對角線電泳技術進行分離。,,,,,+,-,+,-,,,第二向,第一向,,,,,,,,,,,Brown和Hartlay對角線電泳圖解,pH6.5圖中黃色斑點是含有二硫鍵的肽段,,,,S,,S,,,,HCOOOH,,,SO3H,SO3H,,,,,,,+,-,+,-,,,第二向,第一向,,,,,,,,,,,,ab,,,Brown和Hartlay對角線電泳圖解,pH6.5圖中a、b兩個斑點是由一個二硫鍵斷裂產(chǎn)

35、生的肽段,同源蛋白質(zhì)：來自不同生物體、 執(zhí)行同一 /相似功能的蛋白質(zhì) 同種蛋白質(zhì)：來自相同生物體、 執(zhí)行同一功能的蛋白質(zhì),1、同源蛋白質(zhì),,同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化,一百多個AA殘基 MW約12.5×103 2 8個不變殘基 細胞色素C的AA序列差

36、異可用于核對各物種間的分類學關系以及繪制系統(tǒng)樹/進化樹。,細胞色素C與系統(tǒng)樹,,invariant residues (yellow) conservative substitutions (blue)nonconservative or variable residues (unshaded),Conservation and variation of cytochrome c sequences,,1、氧合血紅蛋白,（二）同源蛋

37、白質(zhì)具有共同的進化起源,該酶類活性中心的Ser殘基起關鍵作用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、 凝血酶和纖溶酶有序列同源性對底物偏愛不同,2、絲氨酸蛋白酶類,卵清中的溶菌酶（lysozyme）α- 乳清蛋白（lactalbumin）——三級結(jié)構(gòu)很相似 也可能具有共同的祖先。,3、一些功能差異很大的蛋白質(zhì),（三）血液凝固與AA序列的局部斷裂,凝血酶原,血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纖蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄?/p>