抗人類成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(FGFR2)的單鏈抗體的篩選.pdf

1、人類成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（FGFR2）及其配體在胚胎發(fā)育及組織生長(zhǎng)中都扮演著重要的角色，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、遷移等都有著重要的作用。FGFR2-Ⅲb亞型在上皮細(xì)胞中表達(dá),有證據(jù)表明FGFR2-Ⅲb的過(guò)量表達(dá)與癌癥發(fā)展相關(guān)。
　　本課題研究的主要內(nèi)容是通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)從一個(gè)單鏈抗體（Single-Chain Variable Fragment，scFv）文庫(kù)中篩選出能與FGFR2-Ⅲb胞外段相互作用的scFv，并準(zhǔn)備利用哺乳動(dòng)

2、物雙雜交方法進(jìn)一步驗(yàn)證兩者的相互作用。從而為抑制有FGFR2過(guò)量表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的增殖以及癌癥治療奠定一定的基礎(chǔ)。
　　本課題的研究主要包括以下幾個(gè)方面:
　?。?）從Genbank中查詢FGFR2-Ⅲb基因并獲得能與FGFs結(jié)合的胞外段cDNA序列信息，由公司合成cDNA后，將cDNA連接到酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGBKT7中，形成pGBKT7-FGFR2；
　?。?）將pGBKT7-FGFR2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞AH109；

3、
　?。?）擴(kuò)增含有單鏈抗體cDNA的獵物質(zhì)粒文庫(kù)pSF50-scFv以及提取文庫(kù)質(zhì)粒；
　?。?）將單鏈抗體文庫(kù)轉(zhuǎn)化入已含有pGBKT7-FGFR2的AH109，進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)；
　?。?）提取陽(yáng)性AH109克隆的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在氨芐青霉素平板上生長(zhǎng)，從而獲得帶有pSF50-scFv的DH5α，提取pSF50-scFv質(zhì)粒，對(duì)陽(yáng)性克隆的scFv DNA測(cè)序并分析和比較抗體片段的DNA序列；
　

4、　（6）將陽(yáng)性克隆的scFv DNA回轉(zhuǎn)入已含有pGBKT7-FGFR2質(zhì)粒的AH109，進(jìn)一步驗(yàn)證兩者的相互作用；
　?。?）設(shè)計(jì)引物將FGFR2胞外段擴(kuò)增后連接至哺乳動(dòng)物雙雜交質(zhì)粒pACT內(nèi),設(shè)計(jì)引物將陽(yáng)性pSF50-scFv的scFv片段擴(kuò)增后連接至哺乳動(dòng)物雙雜交質(zhì)粒pBIND內(nèi)，為進(jìn)行哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備，以驗(yàn)證FGFR2與篩選得到的scFv在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的相互作用。
　　本課題經(jīng)過(guò)酵母雙雜交得到18個(gè)scFv