抗成纖維細(xì)胞生長因子1單鏈抗體介導(dǎo)的乳腺癌治療研究.pdf

1、學(xué)校代碼：幽分類號(hào)：絲研究生學(xué)號(hào)：星QQ墾!Q至絲密級：玉⑧東北埽冠媳博士學(xué)位論文抗成纖維細(xì)胞生長因子1單鏈抗體介導(dǎo)的乳腺癌治療研究StudiesonbreastcancertreatmentmediatedbyscFvlC9specificforFGF一1作者：施恒亮指導(dǎo)教師：朱筱娟教授學(xué)科專業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)研究方向：腫瘤靶向治療東北師范大學(xué)學(xué)位評定委員會(huì)2011年5月摘要成纖維細(xì)胞生長因子1(Fibroblastgrowthfacto

2、r1，F(xiàn)GF1)是成纖維細(xì)胞生長因子超家族成員之一，具有廣泛的生物學(xué)作用，對多種類型細(xì)胞具有促分裂作用，并能促進(jìn)血管的形成。近年研究結(jié)果表明FGF一1在多種腫瘤組織中高表達(dá)，提示FGF1可能與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移具有一定的相關(guān)性。本研究首先通過免疫組化分析了FGF1在正常乳腺組織、良性纖維瘤和乳腺導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)GF1在乳腺導(dǎo)管癌組織中高表達(dá)。推測FGF1可以作為乳腺癌治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。為此，本實(shí)驗(yàn)室制備了特異性針對F

3、GF1的雜交瘤，并從該雜交瘤中克隆了抗體輕鏈可變區(qū)基因(Variablelightchain，VL)和重鏈可變區(qū)(VariableheavychainVH)基因，構(gòu)建成單鏈抗體(scFvlC9)，以此作為中和FGF1的工具。共表達(dá)GFPscFvlC9與HAFGF1于MCF7細(xì)胞中，免疫沉淀結(jié)果顯示scFvlC9與FGF1共沉淀，表明scFvlC9在體外有效結(jié)合抗原。為了分析scFvlC9的中和能力，通過慢病毒介導(dǎo)scFvlC9在MCF7

4、細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)預(yù)先中和FGF1的生物學(xué)功能，再將細(xì)胞在體回輸?shù)絅OD／SCID小鼠體內(nèi)，分析誘發(fā)小鼠成瘤的能力。結(jié)果顯示預(yù)先中和FGF1明顯地使MCF7誘導(dǎo)腫瘤能力降低，進(jìn)一步證明了FGF1參與了乳腺癌的發(fā)生。為了分析scFvlC9中和FGF1功能的生物學(xué)機(jī)制，隨后將pEGFPC1和pEGFPscFvlC9分別轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞MCF7，免疫熒光染色表明，表達(dá)GFP的細(xì)胞中內(nèi)源性的FGF一1分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，而表達(dá)GFPscFvlC9

5、的細(xì)胞內(nèi)源性的FGF1僅分布在細(xì)胞質(zhì)。說明scFvlC9在MCF7細(xì)胞中表達(dá)阻止了FGF1進(jìn)入細(xì)胞核。FGF一1具有兩條信號(hào)通路，一條是經(jīng)典的受體依賴型信號(hào)通路；另一條是依賴入核的胞內(nèi)信號(hào)通路。由此我們推測scFvlC9影響FGF1入核進(jìn)一步會(huì)阻斷FGF1的胞內(nèi)信號(hào)通路。pEGFPC1和pEGFPscFvlC9轉(zhuǎn)染的MCF7細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，表達(dá)GFP的細(xì)胞周期分布為：G0／G1：5758％，S：2531％，G2／M：1117％，表

6、達(dá)GFPscFvlC9的細(xì)胞周期分布為：G0／G1：7382％，S：916％，G2／M：611％，其G0／G1期的細(xì)胞明顯增多，表現(xiàn)出細(xì)胞衰老的表型，細(xì)胞增殖指數(shù)明顯降低。進(jìn)而，通過定量ELISA實(shí)驗(yàn)證明了scFvlC9的表達(dá)不影響FGF1的胞外分泌。從而推測scFvlC9不影響FGF1的受體依賴型信號(hào)通路。為了進(jìn)一步證明scFvlC9過表達(dá)阻斷了FGF1胞內(nèi)信號(hào)通路，首先通過RTPCR證明FGF1基因本身的表達(dá)水平?jīng)]有受到影響。其次通