紅藻光合作用藻膽體-類(lèi)囊體膜的超分子結(jié)構(gòu)及其對(duì)缺氮的響應(yīng).pdf

1、光合作用是地球上最重要的生化過(guò)程，由光合膜內(nèi)的一系列色素蛋白相互協(xié)作完成。真核紅藻是真核光合生物演化過(guò)程中非常重要的環(huán)節(jié)，其光合系統(tǒng)具有較多和原核藍(lán)藻相似的特點(diǎn)，是具有重要研究意義的光合生物門(mén)類(lèi)。藍(lán)藻和紅藻光合膜的結(jié)構(gòu)比較特殊，類(lèi)囊體膜表面覆蓋了一層外置的光合天線——藻膽體(phycobilisome，PBS)。藻膽體是由藻膽蛋白(phycobiliprote ins，PBPs)和連接蛋白高度有序裝配而成的超分子復(fù)合物，主要有四種拓?fù)浣Y(jié)

2、構(gòu)類(lèi)型:半盤(pán)狀、半橢球狀、束狀和塊狀。
　　在自然環(huán)境中，包括藍(lán)藻和紅藻在內(nèi)的光合生物進(jìn)化出了多種響應(yīng)機(jī)制以適應(yīng)不利的生存環(huán)境。例如，在缺氮環(huán)境中，非固氮藍(lán)藻及紅藻的藻膽體會(huì)被降解，為藻體生存提供氮源。盡管氮元素是限制光合生物生長(zhǎng)的關(guān)鍵性決定因素之一，但目前依然缺乏對(duì)氮脅迫下植物和藻類(lèi)光合膜超分子結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化的直接觀察。而原子力顯微鏡（atomic force microscopy, AFM）技術(shù)是一種在近生理?xiàng)l件下研究天然光合膜

3、超分子結(jié)構(gòu)的強(qiáng)大有效的方法。紫色細(xì)菌及高等植物的光合膜已經(jīng)利用AFM進(jìn)行了詳細(xì)的研究，但有關(guān)藍(lán)藻和紅藻光合膜的AFM研究卻非常少。半盤(pán)狀藻膽體的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)明確，但紅藻的半橢球形藻膽體精確結(jié)構(gòu)依然不清楚。目前對(duì)紅藻藻膽體-類(lèi)囊體膜的超分子結(jié)構(gòu)研究?jī)H局限于原紅藻綱單細(xì)胞紅藻紫球藻Porphyridium cruentum，對(duì)不同進(jìn)化地位的紅藻藻膽體的形貌結(jié)構(gòu)及其在類(lèi)囊體膜上排布模式的多樣性缺乏研究。光合膜超分子結(jié)構(gòu)與光合性能密切相關(guān)，

4、而葉綠素(chlorophyll，Chl)熒光動(dòng)力學(xué)與放氧生物的光合作用密切相關(guān)，這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于紅藻光合作用的研究中，探究了其對(duì)不同生長(zhǎng)條件的適應(yīng)機(jī)制，比如輻照度、溫度、重金屬、鹽度等。然而，有關(guān)營(yíng)養(yǎng)限制后紅藻光合性能的研究相對(duì)缺乏。
　　本論文圍繞紅藻光合膜及藻膽體的結(jié)構(gòu)、性能及環(huán)境調(diào)控，通過(guò)膜生物化學(xué)、AFM、透射電子顯微鏡(transmission electron micro scopy，TEM)以及光譜學(xué)等手段

5、進(jìn)行了多方面的研究，取得了如下研究結(jié)果:
　　一，單細(xì)胞紅藻紫球藻藻膽體-類(lèi)囊體膜超分子結(jié)構(gòu)研究
　　為了研究紅藻藻膽體-類(lèi)囊體膜的表面超分子形貌，我們通過(guò)比較溫和的方法提取了紫球藻的完整藻膽體-類(lèi)囊體膜囊，利用吸收光譜和熒光光譜檢測(cè)了其結(jié)構(gòu)和功能的完整性，利用AFM探究了藻膽體-類(lèi)囊體膜及其上藻膽體的超分子結(jié)構(gòu)。同時(shí)我們分離了完整的藻膽體，電泳檢測(cè)了其組分。我們的研究發(fā)現(xiàn):類(lèi)囊體膜充滿(mǎn)了整個(gè)藻體且大部分區(qū)域平行排布;提取的

6、藻膽體-類(lèi)囊體膜的結(jié)構(gòu)和功能是完整的;藻膽體-類(lèi)囊體膜囊絕大多數(shù)都近似圓形，直徑范圍為0.5-8.5μm，膜囊的厚度范圍為45-65 nm;有的膜囊上存在折疊，說(shuō)明部分膜囊在藻體中的空間形態(tài)并非處于同一平面;在一些膜囊上也會(huì)觀察到缺口，說(shuō)明類(lèi)囊體膜囊之間可能存在連通，以方便物質(zhì)的傳輸，缺口也有可能是膜囊內(nèi)容物流出時(shí)導(dǎo)致的破損;藻膽體在類(lèi)囊體膜表面緊密排布，大部是隨機(jī)無(wú)序排布的;藻膽體為半橢球形，長(zhǎng)約58士4 nm，寬約40士3 nm，高

7、約27士2 nm(n＞300)，在類(lèi)囊體膜上的密度為（384土17）/μm-2(n＞10)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AFM是研究天然狀態(tài)下類(lèi)囊體膜結(jié)構(gòu)及藻膽體結(jié)構(gòu)的強(qiáng)有力手段，相應(yīng)的結(jié)果為我們對(duì)紅藻類(lèi)囊體膜及藻膽體天然結(jié)構(gòu)的理解提供了重要的線索。
　　二.紫球藻藻膽體-類(lèi)囊體膜超分子結(jié)構(gòu)缺氮調(diào)控研究
　　為了揭示紅藻光合膜超分子結(jié)構(gòu)的缺氮調(diào)控機(jī)制，我們利用AFM并輔以其它技術(shù)研究了缺氮過(guò)程中紫球藻類(lèi)囊體膜超分子結(jié)構(gòu)的變化。我們對(duì)

8、藻體的生長(zhǎng)及Chl含量進(jìn)行了測(cè)定，檢測(cè)了藻體及分離的類(lèi)囊體膜、藻膽體光譜的變化，以表征缺氮后藻體的生理生化狀態(tài)，結(jié)果顯示缺氮過(guò)程中藻細(xì)胞數(shù)量增加，但其增殖速率要小于對(duì)照;藻體Chl的含量逐漸降低，說(shuō)明光系統(tǒng)受到了缺氮的影響;光譜變化表明藻膽蛋白的含量逐漸減少到了相當(dāng)?shù)偷乃剑f(shuō)明藻體中大部分藻膽體被降解了，藻體顏色的變化也證明了這一點(diǎn)。為了研究缺氮后藻體內(nèi)類(lèi)囊體膜的整體變化，我們利用TEM觀察了藻體的超薄切片，藻體內(nèi)類(lèi)囊體膜明顯減少，失

9、去了緊密平行排布的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。我們對(duì)分離的藻膽體進(jìn)行了電泳分析，檢測(cè)了缺氮后藻膽體組分的變化。利用AFM掃描了缺氮后的藻膽體-類(lèi)囊體膜，以觀察缺氮后藻膽體-類(lèi)囊體膜及藻膽體超分子結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果顯示類(lèi)囊體膜囊仍然保持了圓形形態(tài)，其直徑隨缺氮時(shí)間延長(zhǎng)有輕微的增加;藻膽體在膜上的密度逐漸降低，缺氮20天時(shí)，藻膽體的密度減少到了僅51/μm-2;藻膽體逐漸變小，缺氮20天后藻膽體的長(zhǎng)寬高分別減少了大約15％、23％、48％，但其仍保留了半球狀的

10、形態(tài);在類(lèi)囊體膜上出現(xiàn)了孔洞，孔洞的分布遍及整個(gè)膜片，隨著缺氮加劇，孔洞變多變大。為了確定缺氮類(lèi)囊體膜上缺失的復(fù)合物為藻膽體，并對(duì)膜上的孔洞問(wèn)題進(jìn)行深入研究，我們進(jìn)一步對(duì)無(wú)藻膽體膜進(jìn)行掃描觀察。最后我們對(duì)嚴(yán)重缺氮的紫球藻進(jìn)行了補(bǔ)氮恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，以確證我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。補(bǔ)氮后，培養(yǎng)液顏色由黃綠色變?yōu)樯罴t色，光譜得到恢復(fù)，類(lèi)囊體膜上藻膽體數(shù)量增多，這些結(jié)果表明重新添加氮源后藻膽體得到了恢復(fù)。AFM獲得的結(jié)果有助于我們更好地理解氮脅迫下類(lèi)囊體膜的變

11、化以及藻膽體的降解機(jī)制。我們的工作第一次直接觀察了光合生物為應(yīng)對(duì)氮脅迫而引起的類(lèi)囊體膜超分子結(jié)構(gòu)的變化。
　　三.半橢球形藻膽體高分辨率結(jié)構(gòu)研究
　　利用AFM天然直觀的優(yōu)勢(shì)，我們對(duì)位于紫球藻類(lèi)囊體膜上的藻膽體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。首先我們對(duì)掃描探針、掃描參數(shù)以及制片方法進(jìn)行了改進(jìn)優(yōu)化。而后對(duì)類(lèi)囊體膜上擁擠狀態(tài)下的規(guī)則排布和不規(guī)則排布藻膽體分別進(jìn)行了AFM掃描，擁擠排布的藻膽體可按長(zhǎng)軸方向分為兩部分，在中間部位有一道明顯的溝回，兩

12、側(cè)可進(jìn)一步觀察到排布相似的圓形溝回，說(shuō)明藻膽體很可能是長(zhǎng)軸對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)一步提高分辨率，我們通過(guò)缺氮、低鹽透析和缺氮恢復(fù)三種方法使類(lèi)囊體膜上藻膽體稀疏，以觀察到更多結(jié)構(gòu)信息。缺氮后類(lèi)囊體膜上藻膽體數(shù)量會(huì)減少，基于這一自然反應(yīng)，對(duì)缺氮20天類(lèi)囊體膜上的藻膽體高分辨率結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。我們可以觀察到比擁擠狀態(tài)下的藻膽體更多的細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)，說(shuō)明稀疏狀態(tài)下的藻膽體更有利于高分辨觀察。在低鹽緩沖液中藻膽體會(huì)從膜上解離，同時(shí)自身也會(huì)發(fā)生解離，因此我們?nèi)?/p>

13、為降低了藻膽體在膜上的密度，破壞了藻膽體結(jié)構(gòu)的完整性。我們觀察到了更多的藻膽體內(nèi)部結(jié)構(gòu)，為我們提供了更多有關(guān)半橢球形藻膽體的結(jié)構(gòu)信息。缺氮恢復(fù)過(guò)程中類(lèi)囊體膜上會(huì)有新的藻膽體合成，膜上會(huì)存在不同合成狀態(tài)的藻膽體，我們通過(guò)對(duì)缺氮恢復(fù)中藻膽體的高分辨形貌觀察初步研究了其合成過(guò)程。結(jié)果顯示藻膽體的大小形態(tài)不均一，尺寸較大的藻膽體結(jié)構(gòu)較為完整，尺寸較小的藻膽體上的溝回較少，說(shuō)明其結(jié)構(gòu)相對(duì)較為簡(jiǎn)單，其上球狀凸起較少，說(shuō)明桿的數(shù)量少，同樣可以觀察到中

14、間明顯的溝回，說(shuō)明藻膽體可能是對(duì)稱(chēng)合成的。我們推測(cè)半橢球形藻膽體首先合成核心結(jié)構(gòu)，然后按長(zhǎng)軸對(duì)稱(chēng)逐漸合成桿，桿的數(shù)量及長(zhǎng)度逐漸組裝成正常水平。綜上，稀疏狀態(tài)下的AFM高分辨率成像從另一角度為我們提供了更多有關(guān)半橢球形藻膽體的結(jié)構(gòu)信息。
　　四.利用葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)研究紫球藻缺氮后的光合性能
　　氮是植物和藻類(lèi)生存所需的最重要營(yíng)養(yǎng)元素之一，而藻類(lèi)的光合性能與氮源的豐度有關(guān)。Chl熒光動(dòng)力學(xué)與光合生物光合作用密切相關(guān)。本論文中，

15、我們利用多色脈沖振幅調(diào)制（multi-color-pulse amplitude modulation, multi-color-PAM）熒光計(jì)檢測(cè)了缺氮紫球藻的活體Chl熒光動(dòng)力學(xué)，包括慢速Chl a熒光動(dòng)力學(xué)、快速光響應(yīng)曲線(rapid light curve，RLC)和快速Chla熒光動(dòng)力學(xué)，分析了缺氮對(duì)光合性能的影響。缺氮后，光系統(tǒng)Ⅱ(photosystemⅡ，PSⅡ)的光化學(xué)效率以及反應(yīng)中心(reaction center,

16、RC)的活性下降，PSⅡ發(fā)生光抑制;光合裝置受損，光能轉(zhuǎn)換效率下降，但電子傳遞能力沒(méi)有下降(ETo/TRo，REo/ETo); PSⅡ供體端的水裂解系統(tǒng)受缺氮影響嚴(yán)重，導(dǎo)致了放氧復(fù)合物(oxygen-evolving complex,OEC)的失活，正向的K-band有力地支持了這一點(diǎn);傳遞到PSⅡ的光能減少導(dǎo)致了更大比例的能量用于光化學(xué)反應(yīng)，熱耗散的比例下降，如qP和qN所示;RLC顯示缺氮藻體對(duì)高光強(qiáng)的耐受力和抵抗力下降;VoI顯示

17、缺氮藻體到達(dá)P相的時(shí)間增加，末端電子受體庫(kù)增大;缺氮后活性反應(yīng)中心的密度降低。我們的研究顯示，氮脅迫后紫球藻的光合裝置受損，光合性能下降。
　　五.多細(xì)胞紅藻條斑紫菜和多管藻藻膽體-類(lèi)囊體膜超分子結(jié)構(gòu)研究
　　為了研究不同紅藻光合膜超分子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，我們以原始紅藻綱的多細(xì)胞大型紅藻條斑紫菜Porphyrayezoensis和真紅藻綱的多細(xì)胞大型紅藻多管藻Polysiphonia urceolata為研究材料，以紫球藻的光

18、合膜研究為基礎(chǔ)，對(duì)這兩種進(jìn)化地位較高的復(fù)雜紅藻藻膽體-類(lèi)囊體膜超分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。我們利用吸收光譜和熒光光譜檢測(cè)了分離的藻膽體-類(lèi)囊體膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，利用AFM對(duì)藻膽體-類(lèi)囊體膜及其上藻膽體的超分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，提取的藻膽體，類(lèi)囊體膜的結(jié)構(gòu)和功能是完整的，分離的條斑紫菜藻膽體-類(lèi)囊體膜形貌主要有兩種類(lèi)型:一種是不規(guī)則膜片，膜上孔洞較多，平整性差，大小約1-10μm，厚度約35-75 nm;一種是同紫球藻類(lèi)似的圓形膜片

19、，直徑約1μm，膜片厚約35-65nm，膜上孔洞少，表面比較平整均一。藻膽體排布緊密無(wú)序，為半橢球形的，邊界不明顯，長(zhǎng)約52 nm，寬約40 nm，高約18 nm。分離的多管藻藻膽體，類(lèi)囊體膜整體形貌不規(guī)則，膜上孔洞較多，平整性差，膜片厚約35-60 nm。藻膽體排布緊密無(wú)序，膜上存在半橢球形藻膽體，長(zhǎng)約49 nm，寬約34 nm，高約23 nm，同時(shí)也存在一些形狀不規(guī)則或者是磚塊狀排列成行的結(jié)構(gòu)，我們推測(cè)膜上除了半橢球形藻膽體外還可能

20、存在其它類(lèi)型的藻膽體。我們第一次利用AFM直接觀察到了大型紅藻的藻膽體-類(lèi)囊體膜的天然形貌，深化了對(duì)紅藻捕光復(fù)合物（light-harvesting complexes，LHC）的研究，對(duì)紅藻光合膜超分子結(jié)構(gòu)以及光合體系的進(jìn)化有更加深入的理解。
　　本論文利用AFM、TEM、PAM分析技術(shù)結(jié)合光譜學(xué)以及生化實(shí)驗(yàn)等手段，對(duì)紅藻光合膜超分子結(jié)構(gòu)及缺氮調(diào)控、半橢球形藻膽體超分子結(jié)構(gòu)、紅藻氮脅迫下光合性能的調(diào)控進(jìn)行了研究。從全新的角度直觀