基于cDNA展示與鄰近連接測(cè)定轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物的One-pot-seq方法.pdf

1、轉(zhuǎn)錄調(diào)控是各項(xiàng)生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，探究其內(nèi)在的分子機(jī)制是當(dāng)今生命科學(xué)研究的核心問(wèn)題，具有重要的意義。全面測(cè)定轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程中涉及的多種蛋白質(zhì)-核酸以及蛋白-蛋白之間的相互作用，是揭示復(fù)雜調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵?，F(xiàn)行的各種針對(duì)于蛋白質(zhì)-核酸互作與蛋白-蛋白互作的檢測(cè)技術(shù)，均有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用范圍。但是由于核酸與蛋白質(zhì)基本檢測(cè)原理的不同，其檢測(cè)體系是相互獨(dú)立的，具有不兼容性，即不能在一個(gè)相同的體系里面，同時(shí)平行檢測(cè)蛋白互作以及蛋白核酸互作。采用現(xiàn)有方法

2、研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控時(shí)，往往會(huì)將蛋白質(zhì)-核酸互作與蛋白-蛋白互作割裂開(kāi)研究，故而無(wú)法獲得完整的反應(yīng)內(nèi)在真實(shí)情況的信息，在構(gòu)建多組分轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)時(shí)存在一定的局限性。因此建立新的兼容性互作檢測(cè)方法十分必要，這樣有助于深入理解轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理，具有廣泛的意義。
　　論文以此為出發(fā)點(diǎn)，基于cDNA展示與鄰近連接技術(shù)，設(shè)計(jì)并建立測(cè)定轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物的One-Pot-seq方法，實(shí)現(xiàn)蛋白-蛋白互作和蛋白-DNA互作在同一實(shí)驗(yàn)體系中的平行測(cè)定。One-Pot

3、-seq方法主要分為三部分，即采用cDNA展示技術(shù)制備條形碼蛋白，實(shí)現(xiàn)蛋白與其編碼cDNA序列的共價(jià)偶聯(lián);通過(guò)原位鄰近連接技術(shù)將互作的條形碼蛋白與調(diào)控的DNA片段進(jìn)行固定形成可擴(kuò)增DNA標(biāo)簽序列，該標(biāo)簽序列實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的序列信息向核酸序列信息的轉(zhuǎn)變;借助巢式PCR方法，通過(guò)測(cè)序解碼DNA標(biāo)簽序列，獲得轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物之間的互作信息。同時(shí)根據(jù)串聯(lián)親和純化原理以及凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)原理設(shè)計(jì)了固相/液相兩種不同的篩選方式，從而適用于不同的測(cè)定樣本。<

4、br>　　論文首先選取c-Fos/c-Jun轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物作為研究對(duì)象，采用固相/液相兩種篩選方式，對(duì)于One-Pot-seq進(jìn)行了原理性驗(yàn)證。測(cè)序后發(fā)現(xiàn)序列類(lèi)型以及連接方式均符合預(yù)期，表明了One-Pot-seq方法的可行性以及篩選方式的特異性與魯棒性，實(shí)現(xiàn)了在同一實(shí)驗(yàn)體系中同時(shí)平行測(cè)定蛋白-蛋白和蛋白-DNA的多種相互作用。
　　其次，為了檢驗(yàn)One-Pot-seq實(shí)驗(yàn)體系的高容量性，我們將c-Fos/c-Jun轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物

5、體系的順式調(diào)控元件與反式作用因子分別進(jìn)行了隨機(jī)合成與隨機(jī)突變，實(shí)現(xiàn)了2×1013（順式調(diào)控元件DNA）與2×1012（反式作用因子）兩種高容量大庫(kù)之間的有效篩選，同時(shí)結(jié)合動(dòng)力學(xué)模擬以及凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)對(duì)于結(jié)果可靠性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明了One-Pot-seq對(duì)于高庫(kù)容篩選體系的適用性。
　　最后采用TRE motif作為誘餌DNA片段對(duì)于小鼠肝臟全局條形碼蛋白庫(kù)進(jìn)行了4次One-Pot-seq固相篩選，釣取其互作蛋白，將第