基于cDNA展示與鄰近連接測定轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物的One-pot-seq方法.pdf

1、轉(zhuǎn)錄調(diào)控是各項生命活動的基礎(chǔ)，探究其內(nèi)在的分子機制是當(dāng)今生命科學(xué)研究的核心問題，具有重要的意義。全面測定轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中涉及的多種蛋白質(zhì)-核酸以及蛋白-蛋白之間的相互作用，是揭示復(fù)雜調(diào)控機制的關(guān)鍵?，F(xiàn)行的各種針對于蛋白質(zhì)-核酸互作與蛋白-蛋白互作的檢測技術(shù)，均有其獨特的優(yōu)勢及應(yīng)用范圍。但是由于核酸與蛋白質(zhì)基本檢測原理的不同，其檢測體系是相互獨立的，具有不兼容性，即不能在一個相同的體系里面，同時平行檢測蛋白互作以及蛋白核酸互作。采用現(xiàn)有方法

2、研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控時，往往會將蛋白質(zhì)-核酸互作與蛋白-蛋白互作割裂開研究，故而無法獲得完整的反應(yīng)內(nèi)在真實情況的信息，在構(gòu)建多組分轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)時存在一定的局限性。因此建立新的兼容性互作檢測方法十分必要，這樣有助于深入理解轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理，具有廣泛的意義。
　　論文以此為出發(fā)點，基于cDNA展示與鄰近連接技術(shù)，設(shè)計并建立測定轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物的One-Pot-seq方法，實現(xiàn)蛋白-蛋白互作和蛋白-DNA互作在同一實驗體系中的平行測定。One-Pot

3、-seq方法主要分為三部分，即采用cDNA展示技術(shù)制備條形碼蛋白，實現(xiàn)蛋白與其編碼cDNA序列的共價偶聯(lián);通過原位鄰近連接技術(shù)將互作的條形碼蛋白與調(diào)控的DNA片段進行固定形成可擴增DNA標(biāo)簽序列，該標(biāo)簽序列實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的序列信息向核酸序列信息的轉(zhuǎn)變;借助巢式PCR方法，通過測序解碼DNA標(biāo)簽序列，獲得轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物之間的互作信息。同時根據(jù)串聯(lián)親和純化原理以及凝膠阻滯實驗原理設(shè)計了固相/液相兩種不同的篩選方式，從而適用于不同的測定樣本。<

4、br>　　論文首先選取c-Fos/c-Jun轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物作為研究對象，采用固相/液相兩種篩選方式，對于One-Pot-seq進行了原理性驗證。測序后發(fā)現(xiàn)序列類型以及連接方式均符合預(yù)期，表明了One-Pot-seq方法的可行性以及篩選方式的特異性與魯棒性，實現(xiàn)了在同一實驗體系中同時平行測定蛋白-蛋白和蛋白-DNA的多種相互作用。
　　其次，為了檢驗One-Pot-seq實驗體系的高容量性，我們將c-Fos/c-Jun轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物

5、體系的順式調(diào)控元件與反式作用因子分別進行了隨機合成與隨機突變，實現(xiàn)了2×1013（順式調(diào)控元件DNA）與2×1012（反式作用因子）兩種高容量大庫之間的有效篩選，同時結(jié)合動力學(xué)模擬以及凝膠阻滯實驗(EMSA)對于結(jié)果可靠性進行了評價，結(jié)果表明了One-Pot-seq對于高庫容篩選體系的適用性。
　　最后采用TRE motif作為誘餌DNA片段對于小鼠肝臟全局條形碼蛋白庫進行了4次One-Pot-seq固相篩選，釣取其互作蛋白，將第