Blue native-PAGE分離復(fù)合物方法的建立及其在膜蛋白質(zhì)復(fù)合物鑒定中的應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)是細(xì)胞生物功能最主要的承擔(dān)者。但大多數(shù)細(xì)胞的生物學(xué)功能都是由蛋白質(zhì)復(fù)合物而非單個(gè)蛋白質(zhì)來完成,蛋白質(zhì)復(fù)合物是蛋白質(zhì)在體內(nèi)發(fā)揮功能作用的一種重要形式。質(zhì)膜作為細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換和信息交流的場所,涉及眾多蛋白質(zhì)的共同作用來完成這些重要的生理功能。因而質(zhì)膜蛋白質(zhì)更加容易形成復(fù)合物,成為了復(fù)合物蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點(diǎn)。對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物尤其是質(zhì)膜蛋白質(zhì)復(fù)合物的鑒定,有利于我們從整體上理解蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。然而,鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合物最主要的限

2、制因素是蛋白質(zhì)復(fù)合物的分離方法。藍(lán)色非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Blue native-PAGE or BN-PAGE)技術(shù)是分離膜蛋白質(zhì)復(fù)合物強(qiáng)有效的工具。這項(xiàng)技術(shù)依靠考馬斯亮藍(lán)G-250染料使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷,同時(shí)采用溫和的非離子型去垢劑增溶膜樣品,使膜蛋白質(zhì)復(fù)合物在近似天然的狀態(tài)下根據(jù)分子量大小得到分離。在蛋白質(zhì)復(fù)合物得到分離后,可以切下第一向的泳道進(jìn)行第二向SDS-PAGE,就能將各個(gè)復(fù)合物的亞基進(jìn)行分離。該方法可以用來研究膜樣品

3、中多種復(fù)合物的組成,然而在突觸質(zhì)膜復(fù)合物方面的研究中卻應(yīng)用的很少。本實(shí)驗(yàn)中,我們建立并優(yōu)化了Blue native-PAGE分離突觸質(zhì)膜蛋白質(zhì)復(fù)合物方法,并成功用于分析D-半乳糖誘導(dǎo)的C57 BL/6小鼠大腦皮層中突觸蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。最近研究發(fā)現(xiàn),通過連續(xù)注射D-半乳糖到嚙鼠動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)與記憶功能的減退,即AGEs與神經(jīng)疾病有關(guān)。在神經(jīng)疾病中出現(xiàn)的學(xué)習(xí)與記憶功能退化或大腦病變都可能與突觸中蛋白質(zhì)的

4、表達(dá)量的變化有關(guān)。為了評(píng)估AGEs對(duì)突觸蛋白質(zhì)表達(dá)的影響,我們結(jié)合使用BN/SDS-PAGE與質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)方法,比較D-半乳糖誘導(dǎo)的C57 BL/6小鼠和正常的C57 BL/6小鼠大腦皮層突觸蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。首先通過不連續(xù)蔗糖密度梯度離心的方法制備突觸質(zhì)膜,然后用Blue native-PAGE結(jié)合SDS-PAGE對(duì)純化的突觸質(zhì)膜樣品進(jìn)行電泳分離,再經(jīng)膠內(nèi)酶解,最后結(jié)合LC-MS/MS質(zhì)譜對(duì)各復(fù)合物的組分進(jìn)行鑒定以及對(duì)誘導(dǎo)組與對(duì)照組

5、進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。我們找到了一些已知的蛋白質(zhì)復(fù)合物如syntaxin1B和synaptotagmin-1,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一種潛在的新的蛋白質(zhì)復(fù)合物,即rab3A和synaptotagmin-1。一共鑒定到了43個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì),這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要參與體內(nèi)的神經(jīng)傳遞、能量代謝以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。同時(shí)我們對(duì)部分感興趣的差異表達(dá)蛋白質(zhì)在Western-Blotting水平進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。另外,我們檢測了MDA和SO

6、D的活性,發(fā)現(xiàn)在D-半乳糖誘導(dǎo)的C57 BL/6小鼠中,SOD的平均活力顯著下降,而MDA水平則上升了。這些結(jié)果表明,在大腦中AGEs的累積導(dǎo)致了活性氧(ROS)的生成,破壞了能量代謝以及減弱了突觸中神經(jīng)傳遞。因此,闡明在AGEs累積過程中的蛋白質(zhì)變化將有利于我們進(jìn)一步了解在神經(jīng)疾病中學(xué)習(xí)與記憶缺損機(jī)制。
　　 總之,本實(shí)驗(yàn)為質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的膜蛋白質(zhì)復(fù)合物的分離純化、膜蛋白質(zhì)的差異分析等提供了一些方法學(xué)上的參考；證明了Bl