纖維素酶生產(chǎn)菌的篩選、誘變及產(chǎn)酶機(jī)制的初步研究.pdf

1、隨著生活水平的提高、人口的增長和工業(yè)化進(jìn)程的加速，全球能源需求逐漸增加。由此產(chǎn)生的能源安全、石油消耗、全球變暖等問題促使世界各國加快對替代能源的研究。生物燃料中纖維素乙醇的開發(fā)利用已成為研發(fā)熱點(diǎn)。天然木質(zhì)纖維素是公認(rèn)最廉價(jià)且貯量最豐富的生物質(zhì)資源。其主要成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素。生物降解纖維素主要通過纖維素酶來實(shí)現(xiàn)，而纖維素酶生產(chǎn)要依靠微生物進(jìn)行。利用誘變、基因工程等技術(shù)對現(xiàn)有菌種進(jìn)行改造提高酶活，是篩選高效纖維素酶生產(chǎn)菌最有效手

2、段。
　　本研究旨在篩選具有強(qiáng)纖維素酶生產(chǎn)能力野生型真菌。以腐爛的野草、樹葉、秸稈為微生物源，以天然纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，劃線分離后接入液體培養(yǎng)基，以濾紙酶活為指標(biāo)，篩選出一株菌能以纖維素為唯一碳源存活并產(chǎn)酶。采用26SrDNA Dl/D2區(qū)測序的方法對菌株進(jìn)行種屬鑒定，結(jié)果為木霉Trichoderma sp，菌株定名為Trichoderma sp.A6。優(yōu)化培養(yǎng)體系以提高酶活;結(jié)果顯示添加10g/L的乳糖可以使濾紙酶

3、活由原始的最高值的0.16IU上升到0.56IU，且在培養(yǎng)2d后即已經(jīng)達(dá)到整個(gè)培養(yǎng)過程中的最大值;乳糖酸的添加不能提高體系的濾紙酶活;添加吐溫80對培養(yǎng)體系4d的酶活有微弱促進(jìn)作用;15g/L添加酵母提取物可以使體系2d的濾紙酶活由0.60IU提高到0.92IU;酵母提取物與吐溫80聯(lián)合添加與單獨(dú)添加對酶活增加的效果并不顯著。確定最適培養(yǎng)條件為:乳糖和酵母提取物兩者的添加比例分別為10g/L和15g/L。
　　以菌株Trichod

4、erma sp.A6作為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變，經(jīng)大量篩選獲得纖維素酶高產(chǎn)誘變菌株2-3D。純化并繼代培養(yǎng)確保其遺傳穩(wěn)定性后，分別采用搖床培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵，提取纖維素酶粗酶液，測其CMC和濾紙酶活，分別達(dá)1.44IU和1.04IU，抽濾過濾粗酶液，利用單寧沉淀析出酶蛋白，真空凍干濃縮，獲得的酶粉末的酶活性大幅提升，較出發(fā)菌株高出近5倍。該菌株經(jīng)多次重復(fù)傳代培養(yǎng)驗(yàn)證，酶活力變化不大，具有較高遺傳穩(wěn)定性，發(fā)酵周期短，產(chǎn)酶水平高。
　　

5、為深入探究誘變效果，對菌株進(jìn)行高通量測序獲得轉(zhuǎn)錄組，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示全部序列平均長度約98bp; De novo拼接得到15763個(gè)unigene，總大小20.37Mb;轉(zhuǎn)錄本總量達(dá)21594條，平均長度1572.65bp;GC比正態(tài)分布，集中于50％-60％;有76％的基因被注釋到其源頭菌株里氏木霉QM6a;KOG功能預(yù)測，有109個(gè)基因注釋于氨基酸生物合成代謝途;分析了兩個(gè)基因(KO號(hào)ko00010，ko00190)在代謝中的作用;