華癸根瘤菌7653R中RND型外排泵家族基因的共生功能研究.pdf

1、雖然細(xì)菌外排泵的研究歷史較長，其涉及的藥物運(yùn)輸功能研究主要集中在病原菌中，根瘤菌中外排泵的研究較少，外排泵系統(tǒng)相關(guān)基因在根瘤菌共生固氮中的功能表型和作用機(jī)制也值得深入研究。本文研究了華癸中慢生根瘤菌7653R中RND家族基因的功能。獲得了如下實驗結(jié)果:
　　一方面，基于前期工作中的根瘤菌7653R轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析發(fā)現(xiàn)MCHK_0866、MCHK_0867兩個基因在共生條件下明顯上調(diào)表達(dá)，這兩個基因表達(dá)產(chǎn)物組成一個RND型外排泵。對

2、外排泵編碼基因及候選調(diào)控基因在基因組上的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。采用測定OD600觀察菌株生長曲線的變化。通過測定最低抑菌濃度檢測菌株的藥物敏感性，RT-PCR檢測目的基因經(jīng)特定物質(zhì)處理后表達(dá)量的變化。通過細(xì)菌單雜交系統(tǒng)初步檢測外排泵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。結(jié)果顯示，MCHK_0866和MCHK_0867所編碼蛋白共同組成一個RND家族射流泵。缺失該外排泵后，細(xì)菌生長曲線在穩(wěn)定期OD600數(shù)值降低，對萘啶酸、四環(huán)素和SDS的敏感性發(fā)生變化，萘啶酸處理細(xì)

3、菌后兩個基因的表達(dá)量增加。下游屬于TetR轉(zhuǎn)錄因子家族的基因MCHK_0869表達(dá)產(chǎn)物作用于MCHK_0867的啟動子區(qū)域。該外排泵與萘啶酸的運(yùn)輸有關(guān)，缺失后自生生長受到影響，表達(dá)受到下游轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。MCHK_0867插入失活后對結(jié)瘤能力和固氮酶活影響較大，與雙突變菌株共生表型相似。
　　另一方面，本文選取另外3個在共生根瘤中表達(dá)水平無顯著變化的RND家族基因，分別構(gòu)建了其基因插入失活突變株。對突變菌株進(jìn)行了共生表型實驗。結(jié)果