華癸中慢生根瘤菌ctrA突變體構(gòu)建及其宿主互作蛋白初步篩選.pdf

1、ctrA在α-變形細(xì)菌中普遍存在，是細(xì)菌分裂周期和不對稱分化的調(diào)控因子，在雙組分調(diào)控系統(tǒng)中充當(dāng)應(yīng)答調(diào)節(jié)子。類菌體的發(fā)育也涉及到根瘤菌的分裂分化過程，分析認(rèn)為ctrA基因可能參與根瘤菌類菌體分化或共生固氮，亦可能接受宿主植物來源的控制作用。但是相關(guān)的研究報(bào)道和文獻(xiàn)很少。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建同源雙交換置換載體pJQ200SK-ctrA，試圖直接篩選華癸中慢生根瘤菌7653R ctrA基因插入失活突變體。但是一直未能獲得預(yù)期的突變體

2、，考慮到ctrA基因可能存在突變致死性，本研究調(diào)整了篩選路線和策略，重新構(gòu)建了ctrA滲漏表達(dá)載體pHN-ctrA和雙交換質(zhì)粒，為后續(xù)篩選目標(biāo)突變體奠定了基礎(chǔ)條件。
　　 另外一方面，通過構(gòu)建組成型表達(dá)載體pBBR-ctrA，通過接合轉(zhuǎn)移技術(shù)，將額外拷貝的ctrA引入華癸根瘤菌7653R中，觀察根瘤菌自生條件和共生條件下的生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其不影響7653R在自生培養(yǎng)時(shí)的生長；但是其共生表型為結(jié)瘤數(shù)量減少、固氮酶活性有所降低。熒

3、光定量PCR檢測ctrA表達(dá)量，結(jié)果表明：ctrA在自生和共生條件下呈組成型表達(dá)特點(diǎn)，且在不同時(shí)期根瘤中其表達(dá)水平差異不明顯。引入額外組成型拷貝ctrA可導(dǎo)致根瘤中的表達(dá)量稍增強(qiáng)。
　　 同時(shí)，以構(gòu)建pGBKT7-ctrA質(zhì)粒作為誘餌，通過酵母雙雜交技術(shù)，篩選前期已構(gòu)建的紫云英AD-cDNA文庫。最終結(jié)果獲得4個(gè)陽性克隆，其中包括一個(gè)JUN激酶激活域結(jié)合蛋白。
　　 最后，基于ctrA box序列的保守性，本文對于華癸根