眼點(diǎn)微擬球藻(Nannochlotropsis oculata)和朱氏四爿藻(Tetraselmis chuii)的異養(yǎng)與兼養(yǎng)研究.pdf

1、微藻是具有多種經(jīng)濟(jì)價(jià)值的天然資源，微藻培養(yǎng)及其產(chǎn)物的開發(fā)利用為解決目前的糧食、能源、環(huán)境等問題開辟了新領(lǐng)域。然而，傳統(tǒng)自養(yǎng)培養(yǎng)方式因其細(xì)胞密度低、采收困難和成本過高等局限性制約著微藻的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。越來越多的研究證明，異養(yǎng)和兼養(yǎng)可以有效提高生長速率和生物產(chǎn)量，是實(shí)現(xiàn)微藻超高密度培養(yǎng)的有效途徑，也是促進(jìn)微藻高附加值生物活性物質(zhì)積累的重要手段。基于微藻自身的營養(yǎng)特點(diǎn)，目前能夠?qū)崿F(xiàn)異養(yǎng)和兼養(yǎng)培養(yǎng)的微藻種類有限，且限制微藻利用有機(jī)碳進(jìn)行異養(yǎng)和兼養(yǎng)

2、生長的原因尚不明確。為加深對(duì)異養(yǎng)和兼養(yǎng)藻株生長特性、生理生化特征的認(rèn)識(shí)，推進(jìn)對(duì)微藻高附加值胞內(nèi)活性物質(zhì)的探索，有必要對(duì)更多的微藻開展相關(guān)研究。
　　本文分別以生物產(chǎn)油模式種眼點(diǎn)微擬球藻(Nannochloropsis oculata)和典型餌料微藻朱氏四爿藻(Tetraselmis chuii)為代表，對(duì)它們進(jìn)行了異養(yǎng)和兼養(yǎng)研究，驗(yàn)證了利用平板劃線和抗生素法制備無菌化藻株的可行性;證實(shí)了兩種微藻均可利用合適的碳源分別進(jìn)行異養(yǎng)和兼養(yǎng)

3、生長，解決了一直以來對(duì)于微擬球藻是否可以進(jìn)行異養(yǎng)生長的爭(zhēng)議;探明了兩種微藻可利用的最適碳源的種類和濃度;揭示了不同培養(yǎng)條件下微藻的顯微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞生長和胞內(nèi)組分的特征，為深入探索微藻的營養(yǎng)機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料，也為微藻資源的保護(hù)和合理開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.眼點(diǎn)微擬球藻容易被細(xì)菌污染，且有機(jī)碳濃度越高，風(fēng)險(xiǎn)越大。有機(jī)碳濃度高時(shí)(50mM)，該細(xì)菌可在短期內(nèi)迅速繁殖，嚴(yán)重影響微擬球藻的生長甚至導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡。

4、有機(jī)碳濃度低時(shí)(5mM)時(shí)，微藻可能與細(xì)菌形成了某種共生關(guān)系，藻細(xì)胞密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自養(yǎng)狀態(tài)。共生菌的存在使微藻的生長曲線高低起伏，偏離正常生長曲線應(yīng)有的趨勢(shì)，影響了微藻的正常生長。因此要研究微藻的異養(yǎng)或兼養(yǎng)生長，必須首先對(duì)其進(jìn)行無菌化。
　　2.采用16S rDNA測(cè)序技術(shù)，將眼點(diǎn)微擬球藻中的共生菌準(zhǔn)確鑒定為麥?zhǔn)辖惶鎲伟?Alteromonas macleodii)。平板劃線和抗生素法聯(lián)合使用可以對(duì)眼點(diǎn)微擬球藻成功進(jìn)行無菌化，不同

5、營養(yǎng)方式下，眼點(diǎn)微擬球藻對(duì)抗生素的敏感性不同:自養(yǎng)眼點(diǎn)微擬球藻對(duì)200μg/mL以下濃度的卡那霉素不敏感，對(duì)20～200μg/mL的氯霉素非常敏感。120～200μg/mL卡那霉素處理兼養(yǎng)微擬球藻可以去除共生麥?zhǔn)辖惶鎲伟渲袧舛葹?20μg/mL時(shí)可以使微藻的生長處于最佳狀態(tài)。100μg/mL以下濃度的氯霉素?zé)o法抑制兼養(yǎng)眼點(diǎn)微擬球藻中共生菌的生長，而120μg/mL卡那霉素和20μg/mL氯霉素共同作用可以完全消除兼養(yǎng)微擬球藻中的細(xì)

6、菌，并且不會(huì)對(duì)微擬球藻的兼養(yǎng)生長產(chǎn)生不良影響。
　　3.純培養(yǎng)眼點(diǎn)微擬球藻具有兼養(yǎng)生長能力，對(duì)有機(jī)碳的利用具有選擇性。高濃度的蔗糖、甘油、乙醇和乙酸鈉抑制眼點(diǎn)微擬球藻的兼養(yǎng)生長。蔗糖濃度在10～20 g/L、葡萄糖濃度在5～20g/L、甘油濃度在20～30mM時(shí)，以及乙醇濃度在5～10mM時(shí)，既有利于兼養(yǎng)眼點(diǎn)微擬球藻細(xì)胞生長，又有利于胞內(nèi)油脂合成。經(jīng)BODIPY505/515染色后的乙酸鈉兼養(yǎng)藻細(xì)胞整個(gè)呈亮綠色，說明胞內(nèi)油脂含量極

7、高，且細(xì)胞膨大呈正圓形，直徑比自養(yǎng)條件下大3～4倍。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明，0.1g/L以上濃度的乙酸鈉雖然會(huì)抑制眼點(diǎn)微擬球藻的生長，卻有利于胞內(nèi)油脂形成，且乙酸鈉濃度越大，對(duì)油脂的積累越有利。完全異養(yǎng)條件下，微擬球藻光密度值基本維持不變，將在黑暗中生長2周后的5g/L葡萄糖異養(yǎng)微擬球藻轉(zhuǎn)入光下進(jìn)行培養(yǎng)，微藻恢復(fù)正常生長，說明無光條件下微擬球藻并未死亡，而是進(jìn)行著緩慢生長。
　　4.通過擴(kuò)增微藻18S rDNA與rbcL基因并進(jìn)行分子系統(tǒng)

8、學(xué)分析，將采自南黃海的一株綠藻鑒定為朱氏四爿藻(T.chuii)。甘油對(duì)該藻的兼養(yǎng)生長最有利，1～10g/L的甘油均顯著促進(jìn)藻株生長，15g/L的蔗糖、10～25g/L的葡萄糖、10～20mM的乙醇以及0.1g/L的甘氨酸也對(duì)微藻的生長有不同程度的促進(jìn)作用;濃度大于0.1g/L的乙酸鈉和草酸抑制微藻的生長。嚴(yán)格的異養(yǎng)環(huán)境下，朱氏四爿藻不能利用蔗糖、乙酸鈉、甘油、乙醇、甘氨酸或草酸進(jìn)行異養(yǎng)生長，卻可以利用葡萄糖作為唯一碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長，且

9、葡萄糖濃度越高，藻細(xì)胞密度就越高，但均低于自養(yǎng)狀態(tài)。
　　5.比較了三種培養(yǎng)方式和不同碳氮比(4～24)對(duì)朱氏四爿藻生長參數(shù)和胞內(nèi)產(chǎn)物的影響，結(jié)果表明，自養(yǎng)朱氏四爿藻生長速率慢、細(xì)胞密度低，比異養(yǎng)和兼養(yǎng)更早地進(jìn)入平臺(tái)期。無論是異養(yǎng)還是兼養(yǎng)生長，微藻總脂含量都隨碳氮比的上升而持續(xù)上升，蛋白含量隨碳氮比的下降而持續(xù)下降。碳氮比12可能是朱氏四爿藻生物量積累和多糖形成的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，因?yàn)闊o論是異養(yǎng)還是兼養(yǎng)培養(yǎng)，干重均在此比例時(shí)達(dá)到最大值，同時(shí)