腫瘤細(xì)胞自噬與腫瘤細(xì)胞抗藥性機(jī)理的初步研究.pdf

1、自噬又稱為二型細(xì)胞死亡(typeⅡcelldeath)，是細(xì)胞程序性死亡的一種，其特征是自噬體的聚集。自噬體是一種吞入細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)的雙層膜結(jié)構(gòu)，它與溶酶體融合形成自噬溶酶體。在溶酶體酶的作用下，自噬體吞入的細(xì)胞成分被降解，該過程具有清除受損細(xì)胞器及異常蛋白質(zhì)的重要作用。遭受過度自體消化的細(xì)胞便以凋亡或/和非凋亡的形態(tài)學(xué)特征走向死亡。環(huán)境誘因（如饑餓、高溫、氧化應(yīng)激、激素刺激）或細(xì)胞內(nèi)壓力（受損細(xì)胞器、變異蛋白質(zhì)聚集和微生物侵蝕）會(huì)激活

2、細(xì)胞自噬的信號(hào)通道。
　　 自噬與腫瘤密切相關(guān)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用是雙向的。當(dāng)腫瘤細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)間饑餓、低氧以及在放療和化療藥物作用下，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器增多、蛋白質(zhì)氧化、變異或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集等情況時(shí)，腫瘤細(xì)胞通過自噬途徑降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和異常蛋白，并將所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物重新利用，從而為細(xì)胞合成新的結(jié)構(gòu)提供原料，同時(shí)避免細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑，維持腫瘤細(xì)胞的生存。在臨床上，常表現(xiàn)出對(duì)放療和化療的抗性而大大降低了治療效果。但是，過

3、度的自噬可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞自噬性死亡或凋亡。所以，探討自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、死亡和凋亡的影響，為消除自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用、探尋旨在通過干預(yù)細(xì)胞自噬而起作用的協(xié)同抗腫瘤藥物提供理論依據(jù);為臨床上利用現(xiàn)有的自噬誘導(dǎo)劑或抑制劑作為放、化療的增效藥物提供方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，因此，從事該方面的研究具有重要的理論意義和社會(huì)效益。
　　 本實(shí)驗(yàn)以自噬標(biāo)記蛋白LC3的含量為指標(biāo)，檢測(cè)了中國(guó)人常見的喉癌、下咽癌和乳腺癌等實(shí)體腫瘤內(nèi)自噬的情況，并且研究

4、了熱休克蛋白HSP70，HSP90在腫瘤中的表達(dá)情況以及與腫瘤自噬的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所檢測(cè)的三種癌組織共25例標(biāo)本中均表達(dá)LC3蛋白，說(shuō)明在腫瘤細(xì)胞中，自噬具有一定的普遍性。對(duì)9例下咽癌標(biāo)本的分析顯示，LC3在腫瘤中心部位的表達(dá)量顯著高于正常粘膜部位的表達(dá)量。HSP70泛表達(dá)于被測(cè)的標(biāo)本中，HSP70在正常粘膜和癌邊緣組織中的表達(dá)量要高于癌中心組織的表達(dá)量。HSP90在喉癌、下咽癌的中心組織中高表達(dá)，正常組織中不表達(dá)或表達(dá)量很低。在1

5、4例乳腺癌樣本中有12例樣本中HSP90高表達(dá);同時(shí)，在9例下咽癌樣本中，可觀察到HSP90表達(dá)量與LC3有一定的相關(guān)性。
　　 由于實(shí)體腫瘤內(nèi)部的細(xì)胞往往處于缺血，缺氧以及生長(zhǎng)因子供應(yīng)不足的狀態(tài)，容易誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的自噬，所以我們以缺氧和無(wú)血清培養(yǎng)A549人類肺癌細(xì)胞的方式，體外模擬實(shí)體腫瘤內(nèi)部的環(huán)境，研究了缺氧和無(wú)血清培養(yǎng)對(duì)A549細(xì)胞自噬的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)血清和氮?dú)馀囵B(yǎng)7小時(shí)后，脫落漂浮和死亡的細(xì)胞逐漸增多，未脫落的細(xì)胞內(nèi)

6、自噬活性增強(qiáng)，通過消化細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和細(xì)胞器等維持細(xì)胞的生存，導(dǎo)致細(xì)胞體積減小，該結(jié)果與在體腫瘤細(xì)胞的表現(xiàn)相似。
　　 通過Westernblotting檢測(cè)LC3的量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、吖啶橙染色顯示酸性膜泡以及電鏡觀察自噬泡形成等手段，研究了臨床上常用的抗腫瘤化療藥物5-氟尿嘧啶對(duì)A549細(xì)胞自噬的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度（1-10mg/L）5-氟尿嘧啶處理可以誘發(fā)A549細(xì)胞產(chǎn)生自噬，高濃度(＞10mg/L)5-氟尿嘧啶處

7、理主要導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。進(jìn)一步研究證明，5-氟尿嘧啶與常用的自噬抑制劑3-MA共同作用時(shí)，抑制細(xì)胞增殖的能力比5-氟尿嘧啶單獨(dú)作用更強(qiáng)，說(shuō)明在抑制細(xì)胞自噬的情況下，可在一定程度上增強(qiáng)5-氟尿嘧啶抗腫瘤的效果。通過對(duì)酸性膜泡的形成時(shí)間和協(xié)同效率進(jìn)行比較，初步發(fā)現(xiàn)，5-氟尿嘧啶作用A549細(xì)胞的48h內(nèi)，酸性膜泡形成最多，而在此時(shí)間內(nèi)，3-MA對(duì)5-氟尿嘧啶的增效作用也最強(qiáng)，表明抑制自噬可以增加5-氟尿嘧啶對(duì)A549細(xì)胞的殺傷作用。另外，低濃