灰飛虱抗藥性及其機(jī)理研究.pdf

1、灰飛虱(Laodelphax striatellus(Fallen))是一種重要的多食性害蟲(chóng)，在我國(guó)北方以4齡和5齡若蟲(chóng)越冬；在福建、廣東一帶無(wú)越冬現(xiàn)象，可以常年發(fā)生；生產(chǎn)上主要依靠化學(xué)防治。近年來(lái)，該蟲(chóng)在我國(guó)許多地區(qū)特別是江蘇省頻繁爆發(fā)，且絕大多數(shù)常規(guī)藥劑已不能有效控制其危害，因此，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大損失。為了弄清灰飛虱的抗藥性現(xiàn)狀和抗藥性機(jī)理，建立有效的抗藥性治理措施，提高現(xiàn)有的農(nóng)藥品種的防治效果，本文以篩選獲得的灰飛虱抗性品系和

2、敏感品系及田間抗性品系為材料，詳細(xì)研究了灰飛虱抗性現(xiàn)狀、交互抗性及生化機(jī)理、抗性現(xiàn)實(shí)遺傳力、抗性適合度、抗藥性生化與分子生物學(xué)機(jī)理，取得了多項(xiàng)具有重要理論和實(shí)踐意義的成果。 一、灰飛虱田間種群對(duì)常規(guī)殺蟲(chóng)劑的抗藥性監(jiān)測(cè)及其抗性機(jī)制分析 本文對(duì)我國(guó)6個(gè)省市的8個(gè)灰飛虱田間種群進(jìn)行了殺蟲(chóng)劑抗藥性監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，采集于江蘇的3個(gè)種群抗性倍數(shù)最高，對(duì)吡蟲(chóng)啉表現(xiàn)高抗水平，對(duì)毒死蜱，乙酰甲胺磷和溴氰菊酯表現(xiàn)出中等抗性(抗性倍數(shù)分別

3、為：66-108，31-50，17-24和12-21)。來(lái)自福建與廣東的種群對(duì)吡蟲(chóng)啉，毒死蜱和乙酰甲胺磷表現(xiàn)出中等水平抗性(抗性倍數(shù)分別為：27-29，10-12，和9-13)。然而，來(lái)自山東與云南的灰飛虱種群對(duì)所有的供試殺蟲(chóng)劑均表現(xiàn)為較低抗性水平(抗性倍數(shù)<6)。采自北京的種群對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性最高，與前人報(bào)道的敏感基線接近。除江蘇種群對(duì)氟蟲(chóng)腈和丁硫克百威的敏感性下降外(抗性倍數(shù)為5-8)，其它供試蟲(chóng)群均對(duì)氟蟲(chóng)腈和丁硫克百威表現(xiàn)較高的敏

4、感性。生化測(cè)定證實(shí)，細(xì)胞色素P450單加氧酶與酯酶活力的提高與灰飛虱對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗藥性呈顯著正相關(guān)，乙酰膽堿酯酶的不敏感性也參與導(dǎo)致了灰飛虱多重抗性的發(fā)生。 二、灰飛虱敏感品系和抗性品系的室內(nèi)選育 在室內(nèi)對(duì)采集于北京和建湖的田間灰飛虱種群進(jìn)行敏感性恢復(fù)選育，未接觸任何藥劑的情況下飼養(yǎng)12代，北京敏感品系對(duì)吡蟲(chóng)啉、氟蟲(chóng)腈、溴氰菊酯、毒死蜱、乙酰甲胺磷和丁硫克百威的LD50值分別由0.740，0.100，0.970，1.75，

5、2.08，1，34ng/頭下降為0.505，0.0448，0.700，1，12，0.836和0.601 ng/頭，對(duì)供試殺蟲(chóng)劑的敏感性均有所增強(qiáng)；高抗的建湖灰飛虱田間種群在失去殺蟲(chóng)劑的選擇壓力12代后，對(duì)吡蟲(chóng)啉，氟蟲(chóng)腈，溴氰菊酯，毒死蜱、乙酰甲胺磷和丁硫克百威的抗性水平分別由108，6.90，21.0，34，24和6倍下降到10.4，1.54，2.34，2.07，4.16和1.04倍，除對(duì)吡蟲(chóng)啉的高水平抗性外，中低水平抗性幾乎都恢復(fù)到敏

6、感水平。而用吡蟲(chóng)啉，氟蟲(chóng)腈，毒死蜱和丁硫克百威分別對(duì)建湖品系進(jìn)行連續(xù)12代抗性篩選后，抗性灰飛虱對(duì)這4種殺蟲(chóng)劑的抗性則分別由108倍、6.9倍、34倍、5.97倍，上升到281倍、33.1倍、283倍和52.2倍；其中在篩選的前5代抗性上升較慢，在后幾代抗性很快上升。由此認(rèn)為，灰飛虱對(duì)吡蟲(chóng)啉和毒死蜱極易產(chǎn)生高水平抗性，對(duì)丁硫克百威和氟蟲(chóng)腈的抗性發(fā)展較慢，且停止用藥可以使其敏感性明顯下降，有可能回復(fù)到原來(lái)的敏感性水平。 三、灰飛虱

7、對(duì)毒死蜱的抗性機(jī)理及其交互抗性風(fēng)險(xiǎn)研究 以敏感品系為對(duì)照，測(cè)定了毒死蜱室內(nèi)篩選前后灰飛虱對(duì)不同藥劑的抗性，結(jié)果表明，毒死蜱室內(nèi)篩選11代不僅使毒死蜱的抗性倍數(shù)升高了5.35倍，同時(shí)使乙酰甲胺磷和丁硫克百威的抗性也分別增加了1.64和1，39倍，但氟蟲(chóng)腈、溴氰菊酯和吡蟲(chóng)啉的抗性倍數(shù)經(jīng)過(guò)篩選卻分別變?yōu)槠鹗计废档?，708，0，679和0.304倍。由此認(rèn)為，毒死蜱與乙酰甲胺磷、丁硫克百威有明顯的正交互抗性，而與氟蟲(chóng)腈、溴氰菊酯和吡蟲(chóng)

8、啉沒(méi)有正交互抗性。增效劑增效實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在敏感品系中，PBO和TPP對(duì)毒死蜱的增效比分別為3.04和2.91倍，在抗性品系中，其增效比則分別高達(dá)6.65倍和12.0倍。解毒酶活力測(cè)定結(jié)果表明，灰飛虱抗性品系的多功能氧化酶(MFO)和酯酶(EST)活力分別是田間起始品系的3.21和7.94倍，而谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活力沒(méi)有顯著差異。同時(shí)，測(cè)定灰飛虱抗感品系乙酰膽堿酯酶(AChE)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和敏感性發(fā)現(xiàn)，抗性品系A(chǔ)ChE的Km

9、值顯著的高于敏感品系(比值為2，74)，Vmax值也較敏感品系的顯著增大(比值為1.24)，用氧化型毒死蜱作為抑制劑時(shí)，I50也增加了8.3倍，雙分子速率常數(shù)(Ki)下降了2.26倍。由此認(rèn)為，灰飛虱對(duì)毒死蜱的抗藥性機(jī)理涉及MFO和EST解毒代謝的加強(qiáng)以及靶標(biāo)AChE的不敏感性。 四、灰飛虱對(duì)吡蟲(chóng)啉的抗性機(jī)理及其交互抗性風(fēng)險(xiǎn)研究 以敏感品系為對(duì)照，測(cè)定了吡蟲(chóng)啉室內(nèi)篩選前后灰飛虱對(duì)不同藥劑的抗性，結(jié)果表明，吡蟲(chóng)啉室內(nèi)篩選1

10、1代，除了使吡蟲(chóng)啉的抗性升高1.78倍外，并沒(méi)有其他被試藥劑的抗性升高。其中丁硫克百威的抗性沒(méi)有明顯變化(1.06倍)，溴氰菊酯、毒死蜱、乙酰甲胺磷和氟蟲(chóng)腈的抗性倍數(shù)分別減少為起始品系的0.821，0.786，0.471和0.312倍，由此認(rèn)為，吡蟲(chóng)啉與丁硫克百威、溴氰菊酯、毒死蜱、乙酰甲胺磷和氟蟲(chóng)腈均沒(méi)有正交互抗性。至于和氟蟲(chóng)腈及乙酰甲胺磷等抗性下降顯著的藥劑之間是否存在負(fù)交互抗性，尚需要進(jìn)一步研究.解毒酶活力測(cè)定結(jié)果表明，吡蟲(chóng)啉抗性

11、品系的多功能氧化酶(MFO)和酯酶(EST)活力分別是田間起始品系的3.05和7，81倍，而谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活力沒(méi)有顯著差異。由此認(rèn)為，灰飛虱對(duì)吡蟲(chóng)啉的抗藥性機(jī)理至少涉及到MFO和EST解毒代謝的加強(qiáng)。 五、灰飛虱對(duì)丁硫克百威的抗性機(jī)理及其交互抗性風(fēng)險(xiǎn)研究 以敏感品系為對(duì)照，測(cè)定了丁硫克百威室內(nèi)篩選前后灰飛虱對(duì)不同藥劑的抗性，結(jié)果表明，丁硫克百威室內(nèi)篩選11代使丁硫克百威的抗性升高了4.49倍，但對(duì)溴氰菊酯

12、、毒死蜱、乙酰甲胺磷、吡蟲(chóng)啉，和氟蟲(chóng)腈的抗性倍數(shù)分別有較大程度的下降，分別變?yōu)槠鹗计废档?.426，0.316，0.248，0.153和0.105倍。由此認(rèn)為，丁硫克百威與溴氰菊酯、毒死蜱、乙酰甲胺磷、吡蟲(chóng)啉，和氟蟲(chóng)腈沒(méi)有正交互抗性。解毒酶活力測(cè)定結(jié)果表明，丁硫克百威抗性品系的多功能氧化酶(MFO)和酯酶(EST)活力分別是田間起始品系的2.21和1.92倍，而谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活力沒(méi)有顯著差異。同時(shí)，測(cè)定灰飛虱抗感品系乙酰

13、膽堿酯酶( AChE)的敏感性發(fā)現(xiàn)，用乙酰甲胺磷、丁硫克百威和氧化毒死蜱作為抑制劑時(shí)，敏感品系雙分子速率常數(shù)(Ki)分別是抗性品系的4.98、4.39和3.11倍。由此認(rèn)為，灰飛虱對(duì)丁硫克百威的抗藥性機(jī)理涉及MFO和EST解毒代謝的加強(qiáng)以及靶標(biāo)AChE的不敏感性。 六、灰飛虱敏感性恢復(fù)及殺蟲(chóng)劑之間的交互作用 本研究通過(guò)比較室內(nèi)篩選和室內(nèi)敏感性恢復(fù)飼養(yǎng)品系的抗藥性動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn)田間抗性品系經(jīng)過(guò)室內(nèi)敏感性恢復(fù)飼養(yǎng)后，對(duì)所有被試藥

14、劑的抗性均大幅度下降；而用吡蟲(chóng)啉、毒死蜱和丁硫克百威進(jìn)行抗性篩選的3個(gè)處理，所獲得的抗性品系對(duì)不同藥劑的交互抗性各有差異，其中丁硫克百威篩選的CAR-R品系除了對(duì)丁硫克百威的抗性呈正增長(zhǎng)外，對(duì)其它5種藥劑均呈負(fù)增長(zhǎng)；毒死蜱篩選的CHL-R品系對(duì)毒死蜱、丁硫克百威、乙酰甲胺磷、氟蟲(chóng)腈和溴氰菊酯的抗性倍數(shù)均呈正增長(zhǎng)，只有對(duì)吡蟲(chóng)啉的抗性呈現(xiàn)了少量的負(fù)增長(zhǎng)；同樣，吡蟲(chóng)啉篩選的IMI-R品系對(duì)吡蟲(chóng)啉、丁硫克百威、毒死蜱和溴氰菊酯的抗藥性呈現(xiàn)正增長(zhǎng)

15、，僅對(duì)氟蟲(chóng)腈的抗性略有下降；值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)所有經(jīng)藥劑處理的品系，對(duì)任何藥劑的抗性下降幅度均小于不接觸藥劑的恢復(fù)飼養(yǎng)品系。這表明特定的藥劑處理，雖然不一定對(duì)所有藥劑均產(chǎn)生交互抗性，但確實(shí)可以阻止不同藥劑的敏感性恢復(fù)。進(jìn)一步的生化機(jī)理研究表明，不同藥劑處理均能使灰飛虱維持高水平的解毒代謝酶活力，討論認(rèn)為這可能就是藥劑處理延緩灰飛虱對(duì)不同殺蟲(chóng)劑敏感性恢復(fù)的機(jī)理。 七、灰飛虱種群的抗性遺傳力與抗性適合度研究 在室內(nèi)利用

16、對(duì)吡蟲(chóng)啉，毒死蜱，丁硫克百威產(chǎn)生抗性的3個(gè)灰飛虱品系IMI-R、CHL-R和CAR-R進(jìn)行了抗性遺傳力、生物適合度研究。適合度研究表明，3個(gè)抗性品系的適合度顯著地低于敏感品系，毒死蜱、吡蟲(chóng)啉和丁硫克百威抗性品系的適合度分別是敏感品系的0，372、0.325和0.434倍。由此可見(jiàn)，灰飛虱對(duì)吡蟲(chóng)啉、毒死蜱和丁硫克百威產(chǎn)生抗性后，其適合度均顯著下降。加之灰飛虱的抗性遺傳力較低，故本研究認(rèn)為，通過(guò)適當(dāng)?shù)闹卫?，可以有效延緩甚至阻止灰飛虱的抗藥性

17、發(fā)展。 八、灰飛虱殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)基因的克隆和序列分析 采用相同的方法，對(duì)灰飛虱乙酰膽堿酯酶的cDNA片段進(jìn)行了克隆和序列分析。測(cè)序結(jié)果顯示，成功地從灰飛虱L.striatellus中克隆出兩種AChE基因的cDNA片段，并命名為L(zhǎng)s.αcel、Ls.αce2。序列比對(duì)及同源性分析表明，Ls.αcel與其它昆蟲(chóng)I型AChE基因(αcel)序列相同區(qū)域相似性在90％以上，Ls.αce2與它昆蟲(chóng)II型AChE(αce2)基因序列相