Wolbachia感染對雄果蠅繁殖力的影響機理研究.pdf

1、Wolbachia是普遍存在于節(jié)肢動物和絲狀線蟲體內(nèi)的胞內(nèi)共生菌，它通過雌性卵的細胞質(zhì)傳遞給子代。目前已有研究表明，在全球范圍內(nèi)約有70％的昆蟲種類受到Wolbachia的感染。Wolbachia主要位于節(jié)肢動物的生殖組織中，它能誘導宿主生殖方式發(fā)生多種改變，比如精卵細胞質(zhì)不親和(CI)、雌性化、孤雌生殖和殺雄等，其中CI是Wolbachia引起的最普遍的一種表型，即感染W(wǎng)olbachia的雄性宿主與未感染或感染不同品系Wolbachi

2、a的雌性宿主交配后，胚胎孵化率很低甚至全部死亡。細胞學研究發(fā)現(xiàn)，在CI胚胎中，雄性原核發(fā)育滯后，與雌性原核發(fā)育不同步，最終導致胚胎死亡。由于Wolbachia分布廣泛，且對宿主的生殖方式產(chǎn)生多種影響，因此它已成為最有潛力的媒介昆蟲和農(nóng)業(yè)害蟲生物防治的工具。Wolbachia的研究，尤其是CI機制的研究以及Wolbachia對媒介昆蟲宿主影響的研究已經(jīng)成為國內(nèi)外學者研究的熱點之一。關于CI的分子機制，雖然已經(jīng)有了部分的研究報道，但其確切的

3、機制還未知。我們研究組從Wolbachia感染對果蠅精子育性的角度來研究CI的分子機制。
　　 本研究組前期以Wolbachia感染和未感染的果蠅三齡幼蟲精巢為研究對象，采用microarray技術得到感染和未感染W(wǎng)olbachia果蠅精子發(fā)生早期差異表達至少1.5倍的基因296個。本研究首先從這些差異表達的基因中挑選了7個差異倍數(shù)較大、且可能與生殖相關的基因(CG8627-RA、CG9081-RA、CG5320-RC、CG12

4、052-RP、CG17934-RA、CG17268-RA和CG7929-RA)，通過定量RT-PCR(qRT-PCR)技術對其進行了體內(nèi)驗證，發(fā)現(xiàn)CG8627-RA、CG9081-RA和CG5320-RC的表達由于Wolbachia感染發(fā)生了上調(diào)，而CG12052-RP、CG17934-RA、CG17268-RA和CG7929-RA等基因的表達由于Wolbachia感染發(fā)生了下調(diào)，這與microarray的結果一致。其中CG8627-R

5、A和CG12052-RP在Wolbachia感染和未感染的果蠅精巢中的表達水平具極顯著差異(P＜0.01)；而CG9081-RA、CG17934-RA和CG17268-RA的表達具顯著差異(P＜0.05)；另外兩個基因CG5320-RC和CG7929-RA差異不顯著(P＞0.05)。
　　 由于在microarray分析和qRT-PCR實驗中，CG3767(JHI-26)基因在Wolbachia感染的精巢中都顯示上調(diào)表達，且上調(diào)

6、的倍數(shù)很高。該基因編碼的保幼激素誘導蛋白26最近又被鑒定為黑腹果蠅的一個精子蛋白，而CG17934-RA(Mst84Db)在雄性生殖系中特異表達，且與精子的移動有關，因此，本研究對這兩個基因進一步做了原位雜交實驗，結果顯示JHI-26和Mst84Db在Wolbachia感染和未感染的果蠅三齡幼蟲精巢中都普遍表達，但是JHI-26在感染W(wǎng)olbachia的精巢中的表達量比未感染的高，而Mst84Db的表達情況卻相反，即在感染W(wǎng)olbach

7、ia的精巢中的雜交信號比未感染的要弱。這正表明這兩個基因確實是在果蠅幼蟲精巢中表達，且Wolbachia感染導致JHI-26在果蠅早期精巢中表達上調(diào)，卻使得Mst84Db在果蠅早期精巢中表達下調(diào)。前人的研究發(fā)現(xiàn)，幼蟲發(fā)育期快的Wolbachia感染的雄果蠅，其引起的CI強度越高(胚胎孵化率很低)，而幼蟲發(fā)育期較長的Wolbachia感染雄果蠅引起的CI強度越低。由于JHI-26是保幼激素(JH)特異誘導的一種蛋白，因此Wolbachia

8、可能模擬了JH的功能誘導了JHI-26的大量表達，高水平的JHI-26可能抑制了幼蟲階段精巢的發(fā)育，幼蟲期發(fā)育最快的雄性果蠅產(chǎn)生了未完全成熟的精子，使得受精后雄性原核發(fā)育滯后，導致雌雄原核發(fā)育不同步，最終導致胚胎死亡。
　　 由于CG12052(lola)參與多種生物學過程，如與軸突生長和定向、免疫反應、滋養(yǎng)細胞凋亡、腦的形態(tài)建成、性腺的發(fā)育等有關。已有研究表明，在lola突變果蠅中，滋養(yǎng)細胞凋亡過程受阻，在lola突變果蠅卵巢

9、程序性細胞死亡過程中，染色質(zhì)不能完全濃縮。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在Wolbachia感染的幼蟲精巢中，lola-rp基因的表達是顯著下調(diào)的，因此lola-rp可能在精子發(fā)生過程中起重要作用。為了進一步分析lola-rp在果蠅發(fā)育過程中的作用，我們對下調(diào)顯著的lola-rp做了時空表達分析。組織特異性分析結果顯示，lola-rp在果蠅的腦和卵巢中高表達，在成體精巢中也有一定量的表達，而在幼蟲階段表達量較低，表明其可能在腦的發(fā)育以及生殖細胞的發(fā)

10、生過程中起作用。此外，在胚胎發(fā)育過程中，從3h胚胎開始就檢測到lola-rp的表達，且在整個胚胎期都維持在較高水平，說明黑腹果蠅lola-rp可能是母源性基因，且在早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。
　　 為了深入研究Mst84Db的功能，我們體外合成了Mst84Db的雙鏈RNA，再對未感染W(wǎng)olbachia雄性果蠅進行顯微注射，利用RNAi技術對雄性體內(nèi)Mst84Db基因的表達進行干擾。結果發(fā)現(xiàn)，對4-6d的雄蠅注射dsRNA后

11、，Mst84Db基因的表達水平發(fā)生下調(diào)，在注射dsRNA24h后就起到了干擾的效果，注射后72小時，基因敲降幅度最大。與對照組相比，基因敲降后的雄蠅繁殖能力顯著下降，與未感染W(wǎng)olbachia的雌性果蠅交配后胚胎孵化率顯著低于對照組，這與CI現(xiàn)象類似。另外，對未孵化胚胎的表皮進行研究發(fā)現(xiàn)，表皮上沒有體節(jié)的出現(xiàn)，說明未孵化胚胎停滯于胚胎發(fā)育的早期。因此，Wolbachia感染可能抑制了精子發(fā)生過程中Mst84Db基因的轉(zhuǎn)錄，從而使精子正常