急性脊髓損傷脊髓組織、血漿和腦脊液代謝組學平行研究.pdf

1、脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種高致殘率疾病，涉及細胞毒性、氧化應激和免疫-內(nèi)分泌等多個病理機制[1-3]，其病理過程的復雜性不僅取決于初始的機械損傷，更取決于缺血、缺氧、自由基形成、興奮性毒性等繼發(fā)損傷。目前對于脊髓損傷的治療尚缺乏有效手段，繼發(fā)損傷機制尚未完全明確，脊髓損傷后許多血清生化指標發(fā)生變化，但卻很難發(fā)現(xiàn)特征性生物標志物[1,2,4]。無法對脊髓損傷嚴重程度進行準確判斷和預測。
　　代謝組

2、學(metabolomics)是效仿基因組學和蛋白質組學的研究思想，對生物樣本所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理刺激、遺傳修飾、病理生理變化相對關系的研究方式[5,6]，是系統(tǒng)生物學重要組成部分。其高通量鑒定、定量代謝物的方法為研究脊髓損傷所涉及的復雜的代謝途徑和大量的代謝產(chǎn)物?供了有效手段。近年來已有學者應用不同的代謝組學技術對脊髓損傷后患者或模式動物生物樣本進行分析，建立了相應的代謝組學模型，能夠對不同損傷程度的脊髓損傷進行

3、區(qū)分，但大多數(shù)學者均采用單一生物標本研究策略，篩選潛在標志物以及可能涉及的病理生理過程，尚無對體液標本與脊髓組織進行橫向研究，體液標本是否能夠真實反映損傷后脊髓組織代謝改變以及不同生物樣本間代謝相關關系都尚未明確。
　　研究目的：
　　本研究擬在建立大鼠脊髓損傷模型的基礎上，運用GC-MS代謝指紋技術對脊髓損傷模型動物的血漿、腦脊液和脊髓組織3類生物標本進行非靶向分析，研究脊髓損傷后不同生物樣本中代謝改變及相關關系。建立獼猴

4、脊髓全橫斷損傷模型，驗證血漿（血清）生物樣本在脊髓損傷代謝組學研究中的可靠性和穩(wěn)定性。
　　研究方法：
　　1.大鼠脊髓損傷模型的建立選用成年健康SD大鼠60只隨機分為正常對照組、6小時組、24小時組以及72小時組，每組15只。損傷組應用NYU脊髓損傷模型打擊器建立T9節(jié)段MASCIS脊髓損傷模型，打擊桿重量10g，初始高度25mm。通過建立模型動物質量評定標準評價模型質量，符合實驗設計標準的模型動物用以后續(xù)研究。
　

5、　2.生物標本獲取脊髓損傷大鼠麻醉后，將頭部固定于立體定向架，應用1ml注射器連接27G頭皮針行枕大池穿刺，緩慢抽取腦脊液，量應大于100μl，放入 EP管中儲存。采血針于胸前心尖部行心臟穿刺，成功后連接肝素鋰抗凝真空采血管采集動脈血2ml，靜置10分鐘后離心取血漿。解剖暴露脊髓，獲取打擊中心兩側各1cm內(nèi)脊髓組織，置于凍存管內(nèi)放入液氮中速凍。所有標本-80℃儲存?zhèn)錂z。建立生物樣本質量評價標準，對所獲取生物標本進行評估，因后續(xù)研究需進行

6、不同生物樣本代謝相關分析，來源于同一動物的所有標本如有一種類型標本出現(xiàn)不合格則該動物所有標本均需廢棄。
　　3.代謝組學分析對獲取的脊髓損傷大鼠生物標本進行衍生化處理，再通過氣相色譜串聯(lián)質譜技術進行分析，得到質譜譜圖，通過峰識別、峰過濾、峰對齊處理后獲得質核比、保留時間、峰面積及Fisher率等GC-MS原始數(shù)據(jù)。通過SIMCA-P軟件對其進行多維數(shù)據(jù)分析，排除異常標本，查找代謝差異物，鑒定脊髓損傷相關代謝通路。
　　4.不

7、同生物標本間代謝相關分析將譜峰數(shù)據(jù)與實驗室自建標準物質譜庫進行對比，指認代謝物，對各組織標本進行靶向代謝組學分析，橫向對比并篩選出體液與脊髓組織中均受脊髓損傷影響的共同代謝通路，對通路中關鍵差異代謝物進行相關分析，以考察體液作為脊髓損傷代謝組學分析標本的可靠性與相關性。
　　5.脊髓損傷獼猴血清代謝組學分析通過建立獼猴脊髓損傷動物模型獲取損傷前、損傷后3小時以及損傷后3天的血清標本，應用GC-MS非靶向代謝指紋技術對其進行分析，查

8、找差異代謝物及脊髓損傷相關代謝通路，并進一步與脊髓損傷大鼠血漿標本代謝數(shù)據(jù)進行對比，以評價血漿（血清）作為脊髓損傷代謝組學分析標本的潛力與可靠性。
　　研究結果：
　　每組隨機選取12套共48套生物標本用于GC-MS分析，血漿標本獲得譜峰478個，通過PCA模型排除異常標本3個，應用OPLS-DA模型及組間比較篩選差異代謝物34種，鑒定脊髓損傷相關代謝通路6條；腦脊液標本獲取譜峰359個，通過PCA模型排除異常標本2個，應用

9、OPLS-DA模型及組間比較篩選差異代謝物20種，鑒定脊髓損傷相關代謝通路2條；脊髓組織標本獲取譜峰673個，應用OPLS-DA模型及組間比較篩選差異代謝物40種，鑒定脊髓損傷相關代謝通路14條。
　　組織間代謝組學平行分析顯示：血漿與脊髓組織共有指認代謝物占脊髓指認代謝物的88.5％，腦脊液與脊髓組織共有指認代謝物占脊髓指認代謝物的75.4%。血漿與脊髓組織共有的受影響代謝通路占脊髓組織調整通路的42.9%；腦脊液與脊髓組織共有

10、的受影響代謝通路占脊髓組織調整通路的23.8%。
　　丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝在本研究脊髓損傷大鼠各種標本中均顯著改變，其關鍵代謝物丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、甘氨酸和絲氨酸在大多標本中成為顯著差異代謝物。
　　對5只脊髓全橫斷損傷獼猴脊髓損傷前后3時間點血清標本進行代謝組學分析，篩選并鑒定出受脊髓損傷影響顯著改變的代謝通路14條，其包含所有前述大鼠血漿脊髓損傷相關代謝通路。

11、
　　研究結論：
　　體液或脊髓組織均可單獨應用于脊髓損傷代謝組學研究，因選取的標本不同得出的差異代謝物與受脊髓損傷影響的代謝通路在數(shù)量和種類上不盡相同，脊髓組織代謝改變更直接的反映了損傷局部病理生理變化，體液代謝改變在部分反映脊髓損傷局部代謝特征的同時還能同時反映出整個神經(jīng)系統(tǒng)甚至生物體應對損傷的代謝改變。
　　血漿（血清）與脊髓組織代謝相關程度更高，反應靈敏，雖然易受機體其它因素影響，但仍能表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，適合

12、進行脊髓損傷程度代謝生物標志物的篩選。腦脊液與脊髓組織代謝相關程度相對較低、反應滯后，但其相對封閉、保守、穩(wěn)定的特點更易于準確反映脊髓損傷后脊髓局部長時間段代謝變化，適合用于脊髓損傷預后預測的代謝生物標志物篩選。脊髓損傷組織的代謝變化直接反映了損傷局部代謝特征，適合進行病理生理及損傷機制代謝組學研究。
　　在研究中我們還發(fā)現(xiàn)甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，丙氨酸，天門冬氨酸和谷氨酸代謝兩條代謝通路在脊髓損傷后不同生物樣本中均顯著的改變