維甲酸對(duì)大鼠急性脊髓損傷后血脊髓屏障保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的:
　　在急性脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)早期時(shí)，血-脊髓屏障(blood-spinalcord barrier，BSCB)會(huì)發(fā)生不可逆破壞，導(dǎo)致血管源性脊髓水腫，后者在繼發(fā)性脊髓損傷中起至關(guān)重要作用，大量研究證明，炎癥、自由基及其它眾多因子均與BSCB的破壞有關(guān)。維甲酸(Retinoic acid，RA)是一種維生素A的衍生物，對(duì)于胚胎發(fā)育起著重要作用尤其是在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，能選擇性促進(jìn)神經(jīng)

2、嵴前體細(xì)胞的增殖與分化，也可以通過抗炎、抗氧化、促進(jìn)神經(jīng)再生等多種機(jī)制起到中樞神經(jīng)保護(hù)作用。最近研究表明，維甲酸在大鼠胚胎時(shí)期參與血腦屏障(blood-braincord barrier，BBB)及血脊髓屏障的形成與分化，并促進(jìn)大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接蛋白的表達(dá)。既往研究維甲酸對(duì)BSCB的研究多側(cè)重于其在生理情況下對(duì)血腦屏障和血脊髓屏障的作用。但是在病理情況下，如腦損傷或脊髓損傷時(shí)對(duì)血腦屏障和血脊髓屏障的通透性影響和作用機(jī)制還不

3、清楚。本研究通過脊髓動(dòng)脈夾夾傷法，制備SD大鼠脊髓損傷模型，觀察血脊髓屏障通透性的變化，緊密連接蛋白表達(dá)的改變，以及維甲酸治療后的效果。進(jìn)一步探索維甲酸對(duì)脊髓損傷時(shí)血脊髓屏障保護(hù)作用機(jī)制。
　　第一部分維甲酸對(duì)脊髓損傷后血脊髓屏障的保護(hù)作用及促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)
　　目的:觀察大鼠在急性脊髓損傷早期時(shí)血脊髓屏障的通透性、緊密連接蛋白表達(dá)的變化及神經(jīng)功能恢復(fù)情況，觀察大鼠急性脊髓損傷早期維甲酸對(duì)血脊髓屏障的保護(hù)效應(yīng)。
　　方

4、法:采用動(dòng)脈血管夾(30g，2min)壓迫脊髓的方法來制作大鼠急性脊髓損傷的動(dòng)物模型，用54只SD雌性大鼠造模后，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、脊髓損傷組(SCI)、脊髓損傷維甲酸治療組(SCI+RA)。采用BBB法對(duì)其后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分，在各組動(dòng)物手術(shù)后24小時(shí)，對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉處死，心臟灌注，然后獲得的損傷脊髓節(jié)段組織標(biāo)本進(jìn)行二甲基甲酰胺(DMF)法檢測(cè)伊文氏藍(lán)濃度，免疫熒光雙染法檢測(cè)緊密連接蛋白Occludin和CD31的表達(dá)，通

5、過western blot法來檢測(cè)緊密連接蛋白Occludin，Claudin5，β-catenin，P120-catenin表達(dá)變化。
　　結(jié)果:維甲酸治療組(15 mg/kg)能夠顯著抑制脊髓損傷后伊文氏藍(lán)向脊髓實(shí)質(zhì)的滲透量(P＜0.05);在血管結(jié)構(gòu)中，維甲酸治療能夠維持脊髓微血管的整體結(jié)構(gòu)，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，維護(hù)血脊髓屏障的緊密連接完整。此外，維甲酸能夠顯著抑制脊髓損傷所引起的緊密連接相關(guān)蛋白Occludin，Claudin5

6、，β-catenin，P120-catenin表達(dá)的下調(diào)(P＜0.05)。BBB評(píng)分顯示維甲酸治療組SCI+RA組明顯高于SCI組(p＜0.01)。
　　結(jié)論:維甲酸在脊髓損傷時(shí)能夠通過抑制血脊髓屏障的滲透性，上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)，促進(jìn)大鼠脊髓損傷后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。
　　第二部分維甲酸對(duì)血脊髓屏障的保護(hù)作用是通過上調(diào)自噬后抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑介導(dǎo)的
　　目的:初步探討維甲酸對(duì)血脊髓屏障保護(hù)作用機(jī)制及自噬、內(nèi)質(zhì)

7、網(wǎng)應(yīng)激與血脊髓屏障的破壞的相關(guān)性。
　　方法及結(jié)果：
　　(1)在第一部分實(shí)驗(yàn)中的三組老鼠:假手術(shù)組(Sham)、脊髓損傷對(duì)照組(SCI)、脊髓損傷維甲酸治療組(SCI+RA)，通過免疫熒光法和western blot法分別檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白(P62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(GRP78、PDI、caspase-12、CHOP)的表達(dá)情況。結(jié)果表明在模型組中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)輕微上升，而相對(duì)于模型組

8、維甲酸治療組LC3-Ⅱ表達(dá)顯著增高，相反P62蛋白表達(dá)在模型組輕微下降而在維甲酸治療組顯著下降;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、PDI、caspase-12、CHOP的表達(dá)在模型組都顯著增加，而在維甲酸治療組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78、 PDI的表達(dá)相對(duì)于模型組相比無顯著性差異，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白caspase-12、CHOP的表達(dá)在維甲酸治療組顯著下降。
　　(2)在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，為了探索維甲酸是否通過上調(diào)自噬來抑制內(nèi)

9、質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡的。因此，我們引入了自噬抑制劑3-MA、氯喹(CQ)，結(jié)果顯示當(dāng)阻斷自噬通路時(shí)維甲酸的血脊髓屏障保護(hù)作用被抑制了，維甲酸對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白caspase-12、CHOP的抑制作用也被廢除了，而對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白GRP78、 PDI的表達(dá)無有影響。在體外實(shí)驗(yàn)中，我們用10μM毒胡蘿卜素(TG)誘導(dǎo)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷模型，用維甲酸（1μM或5μM）進(jìn)行藥物干預(yù)，發(fā)現(xiàn)維甲酸能夠抑制胡籮卜素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋