螺旋藻轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化體系的建立與研究.pdf

1、地球上藻類資源豐富并且多樣，開發(fā)前景巨大。同時(shí)藻類分子遺傳學(xué)不斷飛速發(fā)展，使人們對(duì)藻類的研究更加深入。螺旋藻是一種古老而保守的藍(lán)藻，因其營(yíng)養(yǎng)成分豐富，并且應(yīng)用廣泛而備受親睞。利用已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化的螺旋藻作為基因工程受體具有許多優(yōu)點(diǎn)。但螺旋藻的基因工程研究比較緩慢，限制其發(fā)展的一個(gè)重要因素就是缺乏良好的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。本文以藍(lán)藻中的轉(zhuǎn)座子為轉(zhuǎn)座元件，以抗性基因和熒光標(biāo)記基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，建立一種新的螺旋藻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)并且嘗試轉(zhuǎn)化螺旋藻，開發(fā)有效的螺旋藻轉(zhuǎn)化

2、平臺(tái)。
　　 轉(zhuǎn)座子是廣泛存在于生物體內(nèi)可自由移動(dòng)的一段DNA序列，可以通過(guò)切割、整合等過(guò)程將自身攜帶的基因片段轉(zhuǎn)座到其他位置。首先在藍(lán)藻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找合適的藍(lán)藻轉(zhuǎn)座子元件，設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分析發(fā)現(xiàn)，藍(lán)藻簡(jiǎn)單插入序列(IS)同細(xì)菌簡(jiǎn)單插入序列結(jié)構(gòu)類似。根據(jù)細(xì)菌轉(zhuǎn)座子載體結(jié)構(gòu)，將克隆的藍(lán)藻IS序列分別連接到含有egfp標(biāo)記基因，nptⅡ標(biāo)記基因質(zhì)粒的兩端，構(gòu)建人工轉(zhuǎn)座子載體。以螺旋藻為宿主細(xì)胞，利用超聲轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的

3、轉(zhuǎn)座子載體轉(zhuǎn)入到螺旋藻中，結(jié)果顯示含有藍(lán)藻轉(zhuǎn)座元件的載體轉(zhuǎn)化成功。將其在不同品系螺旋藻中進(jìn)行轉(zhuǎn)化后成功得到轉(zhuǎn)化子，證明該轉(zhuǎn)座子載體在螺旋藻中適用的廣譜性。
　　 多細(xì)胞絲狀體的螺旋藻給純化子的篩選帶來(lái)一定困難，本研究將egfp基因連入轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化載體，并且轉(zhuǎn)化后能夠穩(wěn)定表達(dá)。利用高速分選流式細(xì)胞儀(FACS Vantage)技術(shù)，結(jié)合其他篩選方法，成功獲得螺旋藻純化轉(zhuǎn)化藻株，有效避免了后續(xù)螺旋藻野生藻株的污染。這對(duì)于篩選絲狀體的工

4、程菌株提供了一定的參考。
　　 以recA基因?yàn)檎衔稽c(diǎn)的螺旋藻同源重組載體與轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化載體相比，兩者在轉(zhuǎn)化效率上差別不明顯，但同源重組載體更適合線性化后轉(zhuǎn)化，而轉(zhuǎn)座子載體則剛好與之相反。并且在結(jié)果上，同源重組載體的轉(zhuǎn)化子表型單一，轉(zhuǎn)座子載體的轉(zhuǎn)化子表型多樣。
　　 本研究首次利用藍(lán)藻簡(jiǎn)單插入序列構(gòu)建螺旋藻轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化載體，利用egfp基因檢測(cè)轉(zhuǎn)化結(jié)果，并在不同品系螺旋藻中轉(zhuǎn)化獲得成功，開辟了螺旋藻新的轉(zhuǎn)化手段，改進(jìn)了螺旋