非轉(zhuǎn)座子載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因家蠶的研究.pdf

1、家蠶因具有世代周期短、繁殖率高、遺傳背景清楚，后代個體數(shù)量多、能大規(guī)模飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)而成為經(jīng)典遺傳學(xué)研究的模式生物之一。家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以獲得新品種、生產(chǎn)外源蛋白，存在著巨大的發(fā)展?jié)摿秃芨叩睦脙r值。它包括基于轉(zhuǎn)座子載體的家蠶轉(zhuǎn)基因以及基于非轉(zhuǎn)座子載體的家蠶轉(zhuǎn)基因。本研究主要探討非轉(zhuǎn)座子載體介導(dǎo)家蠶轉(zhuǎn)基因的可能性。
　　 人胰島素樣生長因子I(humaninsulin-likegrowthfactor-Ⅰ，hIGF-I)是一種多功

2、能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，在活體內(nèi)外hIGF-I能促進(jìn)多種細(xì)胞的生長和分化，是生長激素功能的主要輔助調(diào)節(jié)因子，并且具有類似胰島素的降血糖活性，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。由于成熟hIGF-I在人血內(nèi)含量不高，且提純技術(shù)難度大。缺少hIGF-I純制品已成為對其進(jìn)行研究與應(yīng)用的主要障礙。家蠶作為一種高效真核表達(dá)系統(tǒng)，在生產(chǎn)基因工程藥物方面有很好的應(yīng)用前景。同時，為了進(jìn)一步探討非轉(zhuǎn)座子載體pIZT/V5-His介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因家蠶表達(dá)外源基因的可能性，

3、我們將人胰島素樣生長因子I(hIGF-I)基因克隆進(jìn)pIZT/V5-His載體中，構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因載體pIZT/V5-His-hIGF-I，并利用精子介導(dǎo)法將其導(dǎo)入家蠶，通過綠色熒光篩選并結(jié)合PCR、Dotblotting等分子鑒定，證實(shí)成功獲得了轉(zhuǎn)基因家蠶，并將其培育至G2代;Western blotting分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因家蠶表達(dá)的重組hIGF-I的分子量約為12.5kD，ELISA檢測結(jié)果顯示，hIGF-I在G2代轉(zhuǎn)基因蠶、后部絲腺

4、、脂肪組織凍干粉中的表達(dá)水平分別為65、411和469ng/g。證實(shí)通過非轉(zhuǎn)座子載體介導(dǎo)可以將外源基因?qū)爰倚Q基因組，并實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)。
　　 此外，為了研究基于基因打靶載體的家蠶轉(zhuǎn)基因，我們以家蠶ovo基因上下游各1.2kb內(nèi)含子區(qū)域片段作為同源臂，將α3啟動子驅(qū)動綠色熒光蛋白(gfp)基因的表達(dá)盒，以及ie-1啟動子驅(qū)動新霉素(neo)抗性基因的表達(dá)盒克隆進(jìn)二同源臂之間，作為正向選擇基因;并將ie-1啟動子驅(qū)動紅色熒光蛋