非轉座子載體介導的轉基因家蠶的研究.pdf

1、家蠶因具有世代周期短、繁殖率高、遺傳背景清楚，后代個體數(shù)量多、能大規(guī)模飼養(yǎng)等優(yōu)點而成為經(jīng)典遺傳學研究的模式生物之一。家蠶轉基因技術可以獲得新品種、生產(chǎn)外源蛋白，存在著巨大的發(fā)展?jié)摿秃芨叩睦脙r值。它包括基于轉座子載體的家蠶轉基因以及基于非轉座子載體的家蠶轉基因。本研究主要探討非轉座子載體介導家蠶轉基因的可能性。
　　 人胰島素樣生長因子I(humaninsulin-likegrowthfactor-Ⅰ，hIGF-I)是一種多功

2、能細胞增殖調(diào)控因子，在活體內(nèi)外hIGF-I能促進多種細胞的生長和分化，是生長激素功能的主要輔助調(diào)節(jié)因子，并且具有類似胰島素的降血糖活性，在醫(yī)學領域具有廣闊的應用前景。由于成熟hIGF-I在人血內(nèi)含量不高，且提純技術難度大。缺少hIGF-I純制品已成為對其進行研究與應用的主要障礙。家蠶作為一種高效真核表達系統(tǒng)，在生產(chǎn)基因工程藥物方面有很好的應用前景。同時，為了進一步探討非轉座子載體pIZT/V5-His介導轉基因家蠶表達外源基因的可能性，

3、我們將人胰島素樣生長因子I(hIGF-I)基因克隆進pIZT/V5-His載體中，構建了轉基因載體pIZT/V5-His-hIGF-I，并利用精子介導法將其導入家蠶，通過綠色熒光篩選并結合PCR、Dotblotting等分子鑒定，證實成功獲得了轉基因家蠶，并將其培育至G2代;Western blotting分析結果顯示轉基因家蠶表達的重組hIGF-I的分子量約為12.5kD，ELISA檢測結果顯示，hIGF-I在G2代轉基因蠶、后部絲腺

4、、脂肪組織凍干粉中的表達水平分別為65、411和469ng/g。證實通過非轉座子載體介導可以將外源基因導入家蠶基因組，并實現(xiàn)外源基因的表達。
　　 此外，為了研究基于基因打靶載體的家蠶轉基因，我們以家蠶ovo基因上下游各1.2kb內(nèi)含子區(qū)域片段作為同源臂，將α3啟動子驅動綠色熒光蛋白(gfp)基因的表達盒，以及ie-1啟動子驅動新霉素(neo)抗性基因的表達盒克隆進二同源臂之間，作為正向選擇基因;并將ie-1啟動子驅動紅色熒光蛋