霉茶總黃酮和蛋白合用對自發(fā)性高血壓大鼠腎臟的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：應用霉茶總黃酮、霉茶蛋白合用對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）進行干預，觀察霉茶總黃酮、霉茶蛋白合用對SHR腎臟的影響，及TLR4信號通路及RAS系統(tǒng)在其中的作用，再通過NRK-52E細胞系對TLR4信號通路在其中的作用進行進一步研究。
　　方法：
　　1、霉茶總黃酮和霉茶蛋白合用對SHR腎臟的影響
　　40只SHR分為SHR組，霉茶總黃酮組，霉茶蛋白組，霉茶總黃酮和蛋白合用組。大鼠適應性飼養(yǎng)及血壓測量訓練3 W后，S

2、HR組大鼠灌胃給予等容量蒸餾水，灌胃容量為10 mL?kg-1體重，霉茶總黃酮組劑量為180 mg?kg-1，霉茶蛋白組劑量為70 mg?kg-1，合用組劑量為（180 mg?kg-1+70 mg?kg-1）。各組大鼠每天灌胃給藥2次，連續(xù)灌胃7周，尾動脈無創(chuàng)測壓法每周測量大鼠血壓并記錄，于末次給藥后1h處死大鼠，迅速鈍性剝離腎臟組織，取部分腎臟組織4％多聚甲醛固定，HE染色觀察腎臟組織形態(tài)學改變。
　　2、霉茶總黃酮和霉茶蛋白合

3、用對SHR腎臟保護作用的機制研究
　　2.1霉茶總黃酮和蛋白合用對SHR腎臟的TLR4信號通路的影響
　　分組和給藥方法同1項。大鼠處死后迅速鈍性剝離腎臟組織，用濾紙吸干水分，取部分組織-80℃保存，一部分通過實時熒光定量PCR法檢測腎臟組織基因TLR-4、NF-κB、IL-6、TNF-α的mRNA表達量。另一部分通過免疫印跡蛋白分析法檢測腎臟組織TLR-4和NF-κB蛋白的表達。
　　2.2霉茶總黃酮和蛋白合用對SH

4、R的RAS系統(tǒng)的影響
　　分組和給藥方法同1項。大鼠處死后迅速鈍性剝離腎臟組織，用濾紙吸干水分，取部分組織-80℃保存，作為實時熒光定量PCR實驗樣本，檢測腎臟組織基因ACE、AngⅡ和CYP11B2的mRNA表達量。
　　3、霉茶總黃酮和霉茶蛋白合用對腎小管上皮細胞TLR4信號通路的影響
　　大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）在含5%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。取NRK-52E接種

5、6孔板，培養(yǎng)24h后，采用10-6 mol/l濃度的AngⅡ刺激腎小管上皮細胞(NRK-52E)24h，后按（正常對照組、AngⅡ組、AngⅡ+霉茶總黃酮組、AngⅡ+霉茶蛋白組、AngⅡ+霉茶總黃酮+蛋白合用組分組方式加入對應藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細胞，一部分提取mRNA，逆轉錄為cDNA，RT-PCR檢測TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α mRNA表達水平。一部分提取蛋白，采用免疫印跡蛋白分析檢測TLR4和NF-κB的蛋

6、白的表達水平。
　　結果:
　　1、各組大鼠體重、血壓、腎臟指數(shù)變化：至實驗結束時，各組間大鼠的體重無統(tǒng)計學差異。與SHR組比較，霉茶總黃酮組、霉茶蛋白組及合用組均可明顯降低 SHR的血壓（P＜0.01）。霉茶總黃酮和霉茶蛋白并沒有使SHR的腎臟指數(shù)發(fā)生改變。
　　2、腎臟病理學改變：HE染色顯示，SHR組大鼠腎小球毛細血管淤血擴張，腎小球旁有炎性細胞灶性浸潤，腎小管旁血管淤血擴張，經(jīng)霉茶總黃酮和霉茶蛋白干預后，炎癥浸

7、潤明顯減輕，且較少的毛細血管擴張，合用組無明顯的炎癥浸潤現(xiàn)象。
　　3、腎臟組織中RAS系統(tǒng)相關成分的mRNA表達改變情況：與SHR組比較，霉茶總黃酮組 AngⅡ的 mRNA表達量明顯降低(P<0.05)，同時ACE和CYP11B2的mRNA表達量明顯降低(P<0.01)；合用組ACE、AngⅡ和CYP11B2的mRNA表達量明顯降低(P<0.01)；而霉茶蛋白組的給藥作用并不明顯。說明霉茶總黃酮和合用組能下調 SHR大鼠腎臟組織

8、中ACE、AngⅡ和CYP11B2的mRNA表達。同時，合用組與霉茶總黃酮組比較，ACE、AngⅡ和CYP11B2的mRNA表達量明顯降低(P<0.05)，說明霉茶總黃酮與蛋白合用后，效果優(yōu)于其單用。
　　4、腎臟組織中TLR4及相關炎性因子的表達改變情況：與SHR組比較，霉茶總黃酮組和合用組基因TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-a的mRNA表達量明顯降低(P<0.01)；而霉茶蛋白組的給藥作用并不明顯。說明霉茶總黃酮和合用

9、組能下調SHR腎臟組織中基因TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-a的mRNA表達。同時，與霉茶總黃酮組比較，合用組基因TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-a的mRNA表達量明顯降低(P<0.01)，說明霉茶總黃酮與蛋白合用后，有一定的協(xié)同作用，效果優(yōu)于其單用。與SHR組比較，霉茶蛋白組、霉茶總黃酮組和合用組TLR4、NF-κB的蛋白表達量明顯降低(P<0.01)；同時，合用組與霉茶蛋白組比較TLR4、NF-κB的蛋白表達量明顯降

10、低(P<0.01)，表明霉茶總黃酮與蛋白合用效果優(yōu)于單用。
　　5、腎小管上皮細胞(NRK-52E)中TLR4及相關因子的表達改變情況：與正常對照組比較，AngⅡ組基因TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-a的mRNA表達量明顯增加(P<0.01)。與 AngⅡ組比較，霉茶總黃酮組基因 TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-a的mRNA表達量明顯降低(P<0.05)，霉茶蛋白組和合用組TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-a

11、的mRNA表達量明顯降低(P<0.01)。且合用組與霉茶總黃酮組比較，基因TLR4、NF-κB和IL-6的mRNA表達量明顯降低(P<0.01)， TNF-a的mRNA表達量明顯降低(P<0.05)。表明霉茶總黃酮與蛋白合用后，效果優(yōu)于單用。與正常對照組比較，AngⅡ組細胞TLR4、NF-κB蛋白的表達明顯增高(P<0.01)。與AngⅡ組比較，霉茶總黃酮TLR4蛋白的表達明顯降低(P<0.05)，NF-κB蛋白的表達明顯降低(P<0.

12、01)；霉茶蛋白組和合用組細胞 TLR4、NF-κB蛋白的表達均明顯降低(P<0.01)。且合用組分別與霉茶總黃酮組和蛋白組比較,細胞 TLR4、NF-κB蛋白的表達均明顯降低(P<0.01)。說明霉茶總黃酮與蛋白合用效果優(yōu)于單用。
　　結論：
　　1、霉茶總黃酮和蛋白合用對SHR腎臟有一定的保護作用。
　　2、霉茶總黃酮和霉茶蛋白合用保護腎臟的作用機制可能與其下調腎臟組織中基因 ACE、AngⅡ和 CYP11B2的