一氧化碳高壓干燥保存法對離體心臟的保護作用.pdf

1、目的：器官移植是很多終末期器官衰竭的治療方法，腎臟及肝臟的器官移植手術在臨床上的發(fā)展及應用相對成熟。隨著外科技術進步及術后免疫抑制藥物應用及術后護理等方面的逐漸成熟，臨床上心臟移植的需求越來越多，但心臟移植手術仍然受到很大限制，而心臟保存是造成此限制的最主要原因。現(xiàn)今公認的心臟有效保存時間只有4-6h[1]。即使在醫(yī)療技術發(fā)達的美國，每年最終能等到心臟移植的患者占等候移植人數(shù)的不足10％[2]。由于心臟是全身耗氧量最大的器官，功能的維持

2、需要氧的持續(xù)性供應，心臟離體后，由于缺氧而引起的不可逆損傷會很快引起心功能的下降。這很大限制了供心來源。如何減少離體心臟的損傷從而延長心臟保存時間，減少離體后心臟的缺血再灌注損傷，是目前的一個研究熱點。而目前保存心臟的方法有多種，包括：浸泡保存；灌注保存；深低溫保存等。臨床主要應用浸泡保存，但由于離體心臟處于缺血缺氧環(huán)境，ATP合成受限，引起心肌細胞鈉鉀泵失活，電解質紊亂，繼發(fā)細胞水腫，長期浸泡使細胞水腫更加嚴重。我們應該考慮創(chuàng)立一種有

3、別于目前保存辦法試圖進一步提高心臟保存時間。CO是一種很強的毒性氣體，同時，他也是人體內(nèi)重要的信號因子，體內(nèi)能自然產(chǎn)生CO，并通過CO作為信號因子，調(diào)節(jié)血管張力、抗凋亡、抑制細胞增殖、抗炎等多種作用?？茖W家們嘗試利用CO的特點運用到保存器官當中，并發(fā)現(xiàn)其在減輕器官缺血再灌注損傷中的作用明顯。通過減少物品的水分延長保存時間的干燥保存法很早就應用到我們?nèi)粘Ｉ钪?，而幾十年前，日本seki教授就發(fā)現(xiàn)自然界有生物通過減少自身水分適應例如高壓、干

4、燥等極端環(huán)境的現(xiàn)象。將干燥保存及CO結合應用到器官保存方法當中，取得了意外的良好效果[3]。這方法通過何種途徑達到延長心臟保存時間仍未有明確的探討，本課題主要探索CO高壓干燥保存的作用機制。以及CO高壓干燥保存法對心臟保存的效果與臨床常用的HTK浸泡保存法作比較。
　　方法：
　　1．1實驗動物與分組
　　選取BALB/c雄性健康小鼠51只，3-6w，體重22-24g，作為供體鼠。供體鼠分為3組：CO組、HTK液組、正

5、常小鼠組（正常組）(每組17只，其中12只保存后取材，行分子生物學及組織學檢測，5只保存后行同種頸部異位心臟移植)，受體小鼠15只，8-10周，25-30g的BALB/c小鼠，所有小鼠均購自于中山大學實驗動物中心，分為三組：CO組、HTK液組、正常小鼠組。
　　1．2供體心的切取及灌注保存方法
　　小鼠術前不禁食禁水，稱體重之后，腹腔注射10％戊巴比妥鈉麻醉，麻醉成功后將小鼠仰臥位固定于手術臺上。手術區(qū)用1％活力碘消毒備皮。

6、10倍光學顯微鏡下(購于上海醫(yī)用光學儀器廠)。T字形剪開小鼠腹腔，提出腸管，將暴露的下腔靜脈及腹主動脈。自下腔靜脈注射4℃肝素0．9％氯化鈉溶液1mL，肝素化后2min剪開放血。剪開膈肌，沿肋骨后緣剪斷肋骨，向頭部翻開胸壁，暴露心臟。高鉀停搏液灌停，使心臟變白，分離主動脈至升主動脈以及肺動脈后切除，8-0絲線結扎并剪斷上、下腔靜脈及其他血管。心肺組織一并分離切除后快速放置于盛有4℃冰凍肝素生理鹽水的培養(yǎng)皿中。供心處理：顯微鏡下修整供心。

7、在顯微鏡下，鈍性分離房間隔，經(jīng)左右心耳，用顯微鑷打開房間隔，聯(lián)通左右心房。經(jīng)主動脈緩慢逆行灌注保存液（根據(jù)分組不同，正常組、HTK保存組供心灌注HTK液，CO高壓干燥保存組供心灌注改良KH液）灌注壓力固定為30cmH2O，灌注時間約為2～3min。正常組供心處理完后分別進行取材行組織及分子生物學檢測或行異位移植手術移植。HTK組供心處理完后置于15ml4℃HTK液中保存24h；CO組供心處理完成后，供心懸掛于高壓氣體罐中保存（PO2：3

8、.2×101.325kPa+PCO：0.8×101.325kPa=4×101.325kPa），并將高壓罐放入4°C冰箱24h，注意留意高壓罐的氣壓改變并及時補充不足的氣體。HTK組及CO組經(jīng)24h保存后分別取材行組織及分子生物學檢測或行頸部異位移植手術。
　　1．3心臟組織學及分子生物學檢查
　　制備冰凍切片，分別采用原位細胞凋亡（Tunel）及核酸氧化8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）熒光染色方法檢測凋亡及氧化損傷情況，蛋白

9、免疫印跡（Westernblotting,WB）方法檢測血紅素加氧酶-1（HO-1）及誘導型一氧化氮合酶（iNOs）的蛋白含量。
　　1．4供體心的移植方法
　　受體小鼠稱體重之后，腹腔注射10％戊巴比妥鈉麻醉，麻醉成功后將小鼠仰臥位固定于手術臺上。消毒右側頸部皮膚后備皮。顯微鏡下切開右側皮膚及筋膜。細心緩慢分離右側頸靜脈及頸動脈，充分游離足夠長度的頸動靜脈后分別用血管夾阻斷血管的近心端和遠心端。結扎頸動靜脈遠端，切開右側的

10、頸動、靜脈，用肝素溶液沖洗血塊，用改良cuff方法，分別用20號及28號留置針軟管作為套管對頸動脈及頸靜脈進行血管套管，套管后血管外翻呈袖帶樣套于軟管上，并用10-0絲線固定。供體心臟（HTK組、CO組、正常組）主動脈套入頸動脈套管內(nèi)，肺動脈套入頸靜脈內(nèi)。在供心移植期間一定要保持供心處于低溫狀態(tài)，在供心表面覆蓋冰沙快，并盡量保持移植時間在相對穩(wěn)定水平，減少移植過程中產(chǎn)生的心臟復溫損傷。完成移植后可開放血管夾，血流恢復后即刻計時，記錄復跳

11、情況及復跳時間，開放后2個小時內(nèi)持續(xù)觀察，對復跳心臟進行評分，根據(jù)供心復灌后收縮強度、顏色及心肌硬度行移植物活力評分，最低0分，滿分5分。
　　結果：Tunnel染色結果顯示CO組心肌細胞凋亡較HTK組明顯減少；8-OHdG染色積分光密度值顯示CO組心肌細胞氧化損傷較HTK組明顯減少；WB結果顯示CO組HO-1蛋白表達明顯上調(diào)（0.295±0.041），高于HTK組（0.054±0.022）和正常組（0.029±0.021）。正常

12、組（0.084±0.007）和CO組（0.126±0.024）iNOs蛋白表達均下調(diào)，明顯低于HTK組（0.378±0.082），結果有統(tǒng)計學差異；CO組復跳率明顯高于HTK組，結果均有統(tǒng)計學差異(P<0.05），異位移植實驗中，正常組（即刻移植）移植后心臟鮮紅，心臟動靜脈紋路清晰，肺動脈-頸靜脈回流通暢，流量大。復跳時間短，復跳后恢復正常心律時間短且全心搏動有力。HTK保存后心臟偏白，心臟較保存前體積變小，全心質地偏硬，移植后開放動靜

13、脈淤血期長（全心因淤血增大），心房復跳，全心淤血較嚴重，呈紅黑色，動靜脈紋理不清，靜脈分支大部分缺失。肺動脈-靜脈回路血流量少，心律失常時間較長。CO保存后離體心臟移植前顏色呈粉紅色，移植后開放動靜脈后有淤血期較正常組稍長，但復跳時間普遍較短，復跳后顏色變深紅，動靜脈紋路基本清晰，部分靜脈分支缺失，肺動脈-靜脈回路尚通暢，但流量較正常組稍少。
　　結論：CO高壓干燥保存方法是一種有效的離體心臟保存方法，在組織檢測中及移植后心臟搏動