柚皮素查爾酮通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、凋亡及PI3K-Akt信號(hào)通路調(diào)控抗膠質(zhì)瘤作用.pdf

1、目的:
　　研究的主要目的是探討柚皮素查爾酮對(duì)U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞和異種移植小鼠模型的體外和體內(nèi)抗膠質(zhì)瘤作用。
　　方法:
　　首先進(jìn)行柚皮素查爾酮對(duì)U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外抗腫瘤作用試驗(yàn)。將U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞中加入不同濃度(0，2.5，5，10，50，75和100μM)柚皮素查爾酮，培養(yǎng)不同的時(shí)間(24，48，72h)，分別用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖。將U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞中加入不同濃度（0，10，50和100μ

2、M）柚皮素查爾酮培養(yǎng)48小時(shí)后，分別用吖啶橙/溴化乙錠和Hoechst33342染色后在熒光顯微鏡下評(píng)估細(xì)胞凋亡。將U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞中加入不同濃度(0，10，50和100μM)柚皮素查爾酮培養(yǎng)48小時(shí)后，在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞中自噬空泡的數(shù)量和大小。將U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞中加入不同濃度(0，10，75和100μM)柚皮素查爾酮培養(yǎng)48小時(shí)后，AnnexinⅤ-FITC和PI染色處理后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)柚皮素查爾酮對(duì)U87MG人

3、膠質(zhì)瘤細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡作用。將U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞首先于無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行饑餓處理4小時(shí)，然后加入不同濃度(0，10，50和100μM)柚皮素查爾酮培養(yǎng)40分鐘和48小時(shí)后用Western blot方法對(duì)柚皮素查爾酮對(duì)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　使用異種移植小鼠模型進(jìn)行柚皮素查爾酮對(duì)U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤作用試驗(yàn)。將U87MG細(xì)胞皮下注射于裸鼠右后肢處建立異種移植小鼠模型。將建模成功小鼠分為

4、5組，分別給予不同劑量柚皮素查爾酮注射(5，20，40 and80mg/kg)。24天后，處死小鼠，測(cè)量腫瘤的重量、長(zhǎng)度和寬度，計(jì)算腫瘤的體積。
　　結(jié)果:
　　柚皮素查爾酮對(duì)U87MG細(xì)胞的增殖有抑制作用，其細(xì)胞毒性作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)，同時(shí)隨著作用時(shí)間的增加而增強(qiáng)。也就是說，柚皮素查爾酮對(duì)U87MG細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用同時(shí)具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性。加入柚皮素查爾酮的U87MG細(xì)胞經(jīng)過吖啶橙/溴化乙錠染色后，通過熒光顯

5、微鏡可觀察到細(xì)胞收縮與細(xì)胞凋亡體的形成。經(jīng)hoechst33342染色后，在熒光顯微鏡下可見染色質(zhì)濃縮，DNA碎片，胞膜空泡。這些都是細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)特征。透射電子顯微鏡觀察表明，柚皮素查爾酮能夠誘導(dǎo)自噬空泡的形成，而且自噬空泡的數(shù)量和體積隨柚皮素查爾酮?jiǎng)┝康脑黾佣黾印Ａ魇郊?xì)胞儀檢測(cè)證明，柚皮素查爾酮能夠誘導(dǎo)U87MG人膠質(zhì)瘤細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡。柚皮素查爾酮同時(shí)能夠抑制磷酸化和非磷酸化的PI3K和Akt蛋白，抑制NF-к B、