應(yīng)用微滴數(shù)字PCR法對(duì)循環(huán)血中環(huán)狀RNA穩(wěn)定性的研究.pdf

1、背景:環(huán)狀RNA(circRNA)是一類閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，不易受到RNA核酸外切酶或RNase R酶的降解，較mRNA能更穩(wěn)定的存在于外周循環(huán)血中，正成為非侵入分子診斷研究的熱點(diǎn)。同時(shí)也正由于這種環(huán)狀結(jié)構(gòu)，造成了逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的“滾環(huán)現(xiàn)象”和對(duì)下一步qPCR定量檢測(cè)方法的影響。
　　微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR:ddPCR)是一種基于終點(diǎn)分析陽(yáng)性反應(yīng)微滴數(shù)和陰性反應(yīng)微滴數(shù)的絕對(duì)定量檢測(cè)方法，而不依

2、賴于反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)強(qiáng)度的具體變化率，因此ddPCR可望克服這一技術(shù)難題，提高對(duì)循環(huán)血中痕量的游離環(huán)狀RNA定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。另一方面，環(huán)狀RNA在循環(huán)血中的穩(wěn)定性，和樣品處理過(guò)程對(duì)環(huán)狀RNA定量檢測(cè)數(shù)據(jù)變異度的影響，是影響環(huán)狀RNA作為非侵入性分子診斷研究的前提。
　　目的:本研究首先探討環(huán)狀RNA反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中存在的“滾環(huán)現(xiàn)象”對(duì)qPCR定量檢測(cè)的影響，并通過(guò)對(duì)比RT-qPCR和RT-ddPCR兩種不同檢測(cè)方法對(duì)環(huán)狀RNA表達(dá)

3、水平定量檢測(cè)的結(jié)果，擬評(píng)估ddPCR用于定量檢測(cè)環(huán)狀RNA的有效性。最后本研究運(yùn)用ddPCR檢測(cè)了循環(huán)血中游離環(huán)狀RNA的穩(wěn)定性和樣本處理過(guò)程對(duì)環(huán)狀RNA濃度的影響，評(píng)估環(huán)狀RNA作為分子標(biāo)志物的可行性。
　　方法:實(shí)驗(yàn)一、環(huán)狀RNA逆轉(zhuǎn)錄(RT)過(guò)程中的“滾環(huán)現(xiàn)象”對(duì)RT-qPCR定量檢測(cè)結(jié)果的影響:(1)抽取外周靜脈血，提取總RNA，與RT反應(yīng)物混合后，平均分為5等分;(2)分別給予15min（分鐘），30min，60min，

4、90min，和120min的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得不同的cDNA產(chǎn)物，進(jìn)一步行PCR反應(yīng)，qPCR和ddPCR反應(yīng);(3)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶，并比較qPCR和ddPCR對(duì)相同cDNA的定量結(jié)果。
　　實(shí)驗(yàn)二、環(huán)狀RNA在血清和血漿中的穩(wěn)定性:(1)抽取外周靜脈血于血清管和EDTA抗凝管，然后分為2組;(2)組1的血清管和EDTA抗凝管樣本，立即給予2步離心法，分別獲得血清和血漿，然后分離了的血清和血漿于室溫保存預(yù)設(shè)的

5、時(shí)間點(diǎn)后，提取RNA，進(jìn)行RT-ddPCR反應(yīng)。組2的血清管和EDTA抗凝管樣本，先予室溫保存預(yù)設(shè)的時(shí)間點(diǎn)后，再給予2步離心法，分別獲得血清和血漿，并提出RNA，進(jìn)行RT-ddPCR反應(yīng);(3)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:(1)環(huán)狀RNA的RT-PCR反應(yīng)可產(chǎn)生多條帶產(chǎn)物，隨RT反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，長(zhǎng)條帶產(chǎn)物增加，表明環(huán)狀RNA特殊的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中產(chǎn)生“滾環(huán)現(xiàn)象”，可生成包含外顯子串聯(lián)體的長(zhǎng)單鏈cDNA。(2)隨著

6、RT反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，qPCR對(duì)環(huán)狀RNA的定量結(jié)果增加，而ddPCR對(duì)環(huán)狀RNA的定量結(jié)果保持不變。(3)環(huán)狀RNA在及時(shí)分離的血清/血漿樣本可穩(wěn)定存在達(dá)24小時(shí)。(4)6小時(shí)內(nèi)分離血細(xì)胞，不影響環(huán)狀RNA在血清/血漿中的濃度。(5)環(huán)狀RNA在延遲24小時(shí)分離血細(xì)胞的血清/血漿中濃度下降。
　　結(jié)論:ddPCR不受逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中“滾環(huán)現(xiàn)象”產(chǎn)生的長(zhǎng)單鏈cDNA的干擾，較qPCR能更準(zhǔn)確地用于環(huán)狀RNA的定量檢測(cè)。環(huán)狀RNA可在人血