中藥白頭翁質(zhì)量控制和白樺脂酸體內(nèi)外代謝研究.pdf

1、白頭翁（Pulsatilla chinensis（Bge.）Regel）為毛茛科（Ranunculaceae）白頭翁屬（Pulsatilla）植物，是常用的傳統(tǒng)中藥之一，具有清熱解毒、燥濕殺蟲和涼血止痢等功效。臨床上被廣泛地用于細菌性痢疾、阿米巴痢疾、陰道滴蟲、細菌感染和惡性腫瘤等疾病的治療。白頭翁在我國河北、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、安徽、河南以及湖北等省均有廣泛分布，且不同產(chǎn)地的白頭翁化學成分存在明顯差異。因此，定量和定性分析白頭翁中主要

2、的有效成分對于藥材的質(zhì)量評價十分重要。中藥作為復雜成分體系，其質(zhì)量控制研究需圍繞“多成分”、“多靶點”的特點。故本研究建立了液質(zhì)聯(lián)用（UPLC-ESI-MS/MS）技術結合組織破碎法同時測定白頭翁中12個主要化學成分含量的方法，并采用主成分分析方法對不同產(chǎn)地的白頭翁進行質(zhì)量分析，為白頭翁藥材的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。建立UPLC-Q-TOF-MS/MS法分析總結五環(huán)三萜皂苷類成分及其同分異構體的質(zhì)譜裂解規(guī)律，并且結合全面、系統(tǒng)的五環(huán)三萜皂

3、苷類化合物的定性分析策略，快速識別和鑒定白頭翁中五環(huán)三萜皂苷類化合物以及同分異構體。最終鑒定出22個五環(huán)三萜皂苷類化合物，并且區(qū)分兩大類、11對同分異構體。本研究為闡明中藥材質(zhì)量差異提供了有效的技術手段，并為富含五環(huán)三萜皂苷類成分中藥的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)，從而為全面深入地研究中藥活性化學成分與中藥藥效的相關性奠定基礎。
　　白樺脂酸（Betulinic acid, BA）是一種五環(huán)三萜類有機酸，為白頭翁中主要活性成分之一。藥理學

4、研究表明其對HIV-1型感染具有抑制作用，并且具有抗腫瘤活性。本實驗建立借助UPLC-Q-TOF-MS/MS技術鑒定白樺脂酸體內(nèi)外代謝物的檢測方法，并將其運用于給藥大鼠糞便及微生物轉化的代謝物鑒定，并推斷其代謝途徑，探尋白樺脂酸在體內(nèi)的代謝過程，為白頭翁中五環(huán)三萜皂苷類成分的體內(nèi)代謝研究提供理論依據(jù)。
　　第一部分：液質(zhì)聯(lián)用法同時測定白頭翁藥材中12種主要化學成分及其主成分分析
　　目的：建立UPLC-ESI-MS/MS方法

5、同時測定白頭翁藥材中β-蛻皮甾酮、筋骨草甾酮C、常春藤皂苷C、刺人參皂苷S、白頭翁皂苷C、23-羥基羽扇豆-20（29）-烯-28-酸-3-O-[阿拉伯糖基-吡喃鼠李糖基]-28-O-[吡喃葡萄糖酯苷]（C47H76O17）、白頭翁皂苷B4、常春藤皂苷B、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、23-羥基白樺脂酸和常春藤皂苷元12種成分的含量，并采用主成分分析方法（PCA）對不同產(chǎn)地白頭翁進行質(zhì)量分析，為白頭翁藥材質(zhì)量標準的建立和質(zhì)量控制提供依

6、據(jù)。
　　方法：采用Phenomenex Kinetex-C18色譜柱（100×3 mm，2.6m），流動相為甲醇含0.1％甲酸-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫，流速為0.4 mL/min，柱溫為40oC。采用電噴霧離子源進行正、負離子模式掃描，多反應監(jiān)測模式進行定量測定。離子源溫度為150oC，毛細管電壓為2.0 kV，脫溶劑氣溫度為500oC，脫溶劑氣流量為800 L/Hr，錐孔氣流量為150 L/Hr，霧化氣壓力為7.0 Ba

7、r，接口處加熱。
　　結果：12種主要化學成分的峰面積和濃度在測定濃度范圍內(nèi)線性關系良好，儀器重復性、日內(nèi)和日間精密度、溶液穩(wěn)定性均符合要求。平均加樣回收率為97.6-104.2%，RSD小于4.7%。定量分析結果顯示，不同產(chǎn)地的33批白頭翁藥材中均含有刺人參皂苷S，然而其在不同產(chǎn)地藥材中的含量具有明顯的差異。PCA結果顯示，33批樣品在主成分空間中聚集成兩大類，表明產(chǎn)地對藥材的質(zhì)量差異產(chǎn)生一定的影響。
　　結論：本研究建立

8、的分析方法具有操作簡便、快速、專屬性強、靈敏度高的優(yōu)勢，可應用于白頭翁藥材中多種活性成分的同時定量測定。同時， PCA法可為白頭翁藥材分類和質(zhì)量評價提供依據(jù)，有助于合理、規(guī)范地指導中醫(yī)臨床用藥。
　　第二部分：基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術快速鑒定白頭翁中五環(huán)三萜皂苷類化合物
　　目的：研究并總結五環(huán)三萜皂苷類化合物在正負離子模式下的電噴霧質(zhì)譜裂解規(guī)律，建立全面、系統(tǒng)的化合物鑒定分析策略，鑒定白頭翁中五環(huán)三萜皂苷化

9、學成分及同分異構體。
　　方法：首先采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術，電噴霧離子源正、負離子模式下一級質(zhì)譜掃描、母離子掃描和子離子掃描模式，研究了8個具有代表性的五環(huán)三萜皂苷類成分對照品的質(zhì)譜裂解途徑，總結其規(guī)律。結合相關文獻，建立白頭翁屬植物五環(huán)三萜皂苷化合物的質(zhì)譜庫。通過對化合物精確質(zhì)量數(shù)、碎片離子信息和保留時間分析，鑒定白頭翁中五環(huán)三萜皂苷類化學成分。色譜柱為Agilent Poroshell120 SB-C18色譜

10、柱（2.1 mm×100 mm，2.7μm），柱前具有配套的預柱；柱溫為40oC；流動相為水-0.1%甲酸（A）~甲醇-0.1%甲酸（B），流速為0.3 mL/min，采用梯度洗脫方式，進樣前預平衡10 min，進樣量為5μL。
　　結果：通過與對照品的色譜行為、精確質(zhì)量數(shù)和二級碎片信息對比，分別對8個五環(huán)三萜皂苷色譜峰進行歸屬。峰3、4、7、14、17、18、21和22分別被鑒定為白頭翁皂苷B4、常春藤皂苷C、白頭翁皂苷C、常春

11、藤皂苷B、白頭翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、23-羥基白樺脂酸和常春藤皂苷元。同時，基于化合物鑒定分析策略推斷出22個（11對）五環(huán)三萜皂苷的化學結構。
　　結論：本研究所建立的UPLC-Q-TOF-MS/MS方法靈敏度高、專屬性強，其分析策略可為白頭翁屬其他植物以及傳統(tǒng)中藥化學成分的定性分析鑒定提供有力的技術支持，對控制中藥材質(zhì)量具有十分重要的意義。
　　第三部分：UPLC-Q-TOF-MS/MS法鑒定白樺脂酸大鼠體內(nèi)外代謝

12、物
　　目的：采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術對大鼠口服給予白樺脂酸后糞便中的代謝產(chǎn)物及腸道菌微生物轉化的代謝產(chǎn)物進行結構鑒定，并推測其代謝途徑。
　　方法：首先，采用液-液萃取方法對生物樣品進行預處理， UPLC-Q-TOF-MS/MS方法采集數(shù)據(jù)。第二步，運用MetabolitePilot1.5軟件中的多種數(shù)據(jù)后處理技術（提取離子流色譜、多重質(zhì)量虧損過濾、碎片離子過濾和中性丟失過濾）對采集到的數(shù)據(jù)進行準確快速的提

13、取和識別，獲得代謝物的精確質(zhì)量數(shù)、元素組成和MS/MS質(zhì)譜圖。最后根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)、相關的生物代謝轉化規(guī)律和白樺脂酸的裂解規(guī)律，對白樺脂酸的代謝產(chǎn)物進行結構推斷并且利用Clog P值輔助區(qū)分同分異構體。
　　結果：基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術，大鼠口服給予白樺脂酸后糞便樣品及腸道菌微生物轉化樣品中除母藥外共檢測到46個代謝物，腸道菌微生物轉化樣品檢測到20個代謝物，大鼠糞便樣品檢測到35個代謝物，有7個代謝物在兩種生物樣