白頭翁質(zhì)量評(píng)價(jià)與五環(huán)三萜皂苷類成分的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、白頭翁(Pulsatilla chinensis(Bunge)Regel)是毛茛科植物白頭翁的干燥根[3]，主要分布于亞洲、歐洲和北美洲等地區(qū)。白頭翁具有清熱解毒、涼血止痢的功效，臨床上被廣泛用于阿米巴性痢疾、瘧疾、陰道滴蟲、細(xì)菌感染和惡性腫瘤等疾病的治療。近年來，由于白頭翁藥材具有明顯的抗腫瘤[6-11]作用而越來越被廣泛關(guān)注。故本課題對(duì)白頭翁藥材進(jìn)行了系統(tǒng)地分離、質(zhì)量評(píng)價(jià)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。
　　本實(shí)驗(yàn)采用大孔吸附樹脂法，硅

2、膠柱色譜法、葡聚糖凝膠和反相柱色譜法對(duì)白頭翁藥材進(jìn)行系統(tǒng)分離，并建立了一個(gè)簡(jiǎn)單、快速的HPLC-ESI-MS法同時(shí)定量測(cè)定白頭翁藥材中9種化學(xué)成分。在對(duì)其進(jìn)行定性研究中，利用HPLC-ESI-MS/MS聯(lián)用技術(shù)分析研究了8個(gè)五環(huán)三萜皂苷類化合物的特征碎片離子，推測(cè)其電噴霧質(zhì)譜裂解規(guī)律，最終在白頭翁提取物中推導(dǎo)出了37個(gè)五環(huán)三萜皂苷化合物的結(jié)構(gòu)。在藥代動(dòng)力學(xué)研究中，首次建立了一種靈敏的、可靠的多次切換監(jiān)測(cè)模式HPLC-MS方法同時(shí)測(cè)定大鼠

3、灌胃給予白頭翁提取物后大鼠血漿中4種三萜皂苷的含量，并應(yīng)用于藥代動(dòng)力學(xué)研究。首次對(duì)大鼠口服白頭翁提取物后膽汁中6種五環(huán)三萜皂苷類化合物進(jìn)行分析測(cè)定，并對(duì)這些三萜皂苷的膽汁排泄輪廓進(jìn)行研究。綜上對(duì)白頭翁藥材的系統(tǒng)研究將為其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供全面的理論依據(jù)。
　　第一部分白頭翁化學(xué)成分研究
　　目的：研究藥材白頭翁(Pulsatilla chinensis(Bunge)Regel)中的化學(xué)成分。
　　方法：取粉碎后的白頭翁

4、約10 kg，用70％乙醇冷浸提取3次，采用AB-8大孔吸附樹脂進(jìn)行分離，收集70％乙醇洗脫液部分，得浸膏(總苷)約500 g。采用大孔吸附樹脂法，硅膠柱色譜法、葡聚糖凝膠和反相柱色譜法對(duì)白頭翁藥材進(jìn)行系統(tǒng)分離，并用波譜和化學(xué)方法鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：從白頭翁的70％乙醇提取物中分離得到9個(gè)單體化合物，對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，其中包括5個(gè)五環(huán)三萜皂苷，2個(gè)三萜酸，2個(gè)甾酮類化合物。分別鑒定為齊墩果酸、白頭翁皂苷A3、白頭翁皂苷

5、B4、23-羥基白樺脂酸、刺人參皂苷S、白頭翁皂苷B、白頭翁皂苷C、筋骨草甾酮C和β-蛻皮甾酮。
　　結(jié)論：從白頭翁中分離鑒定了9個(gè)化合物，其中3個(gè)化合物為首次從該植物中發(fā)現(xiàn)，分別為刺人參皂苷S，筋骨草甾酮C和β-蛻皮甾酮。
　　第二部分液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定白頭翁中9種化學(xué)成分及其質(zhì)量表征
　　目的：建立HPLC-MS法測(cè)定白頭翁中白頭翁皂苷B4(1)，白頭翁皂苷A3(2)，23-羥基白樺脂酸(3)，刺人參苷S(4)，

6、白頭翁皂苷C(5)，白頭翁皂苷B(6)，齊墩果酸(7)，β-蛻皮甾酮(8)和筋骨草甾酮C(9)含量的方法。
　　方法：采用Sapphire C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：A(甲醇含0.1％甲酸)-B(0.1％甲酸水溶液)，梯度洗脫程序?yàn)?-6 min(75％-95％A)，6-14 min(95％A)，隨后回到最初75％A并持續(xù)到21 min；流速為0.8 mL·min-1。采用電噴霧離子源進(jìn)行正離子和負(fù)離子模

7、式檢測(cè)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)用于定量測(cè)定。正離子監(jiān)測(cè)模式下源噴射電壓設(shè)置為5500 V；負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式下源噴射電壓設(shè)置為-4500 V；離子源溫度為650℃。霧化氣(Gasl)：40 psi，加熱氣(Gas2)：50 psi，接口持續(xù)加熱，簾氣25 psi，全程氮?dú)馔ㄈ霠顟B(tài)。掃描方式采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；碰撞氣(CAD，N2)壓力為medium；Q1和Q3分辨率均為UNIT。
　　結(jié)果：峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系(r2

8、>0.9948)；日內(nèi)和日間精密度分別小于2.78％和2.68％，并應(yīng)用于20批次不同來源白頭翁藥材的含量測(cè)定。
　　結(jié)論：本研究中建立的分析方法靈敏度高、專屬性好，可為白頭翁藥材質(zhì)量控制提供一個(gè)強(qiáng)有力的工具。有助于規(guī)范白頭翁藥材的質(zhì)量，并能夠在一定程度上指導(dǎo)中醫(yī)臨床用藥的合理性。
　　第三部分液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)定性鑒定白頭翁中五環(huán)三萜皂苷類成分
　　目的：對(duì)白頭翁進(jìn)行超聲提取后即進(jìn)行HPLC-MS分析，研究8個(gè)五環(huán)三萜皂苷

9、類化合物的特征碎片離子，推測(cè)其電噴霧質(zhì)譜裂解規(guī)律，再將此規(guī)律應(yīng)用于白頭翁中未知羽扇豆烷型和齊墩果烷型三萜皂苷類化合物的結(jié)構(gòu)推測(cè)，根據(jù)已知裂解規(guī)律盡可能多的推測(cè)出白頭翁中五環(huán)三萜皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
　　方法：采用了MRM-IDA-EPI和PREC-IDA-EPI兩種模式分析未知五環(huán)三萜皂苷類化合物。取白頭翁藥材粉末(40目)5 g，加70％甲醇25 mL，稱重，冰浴超聲提取1 h，稱重，用70％甲醇補(bǔ)足減失的重量，0.45μm微孔濾膜

10、濾過，濾液減壓蒸干，殘?jiān)? mL的70％甲醇溶解，0.45μm微孔濾膜濾過，進(jìn)行HPLC-MS分析。色譜柱為Sapphire C18(250 mm×4.6mm，5μm)，采用0.1％甲酸甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫75-75％A(0-15 min)；75-80％A(15-30 min)；80-95％A(30-40min)；95-95％A(40-50 min)，流速為700μL·min-1。質(zhì)譜：ESI源；負(fù)離子檢

11、測(cè)源電壓-4500 V；正離子檢測(cè)源電壓5500 V；源溫度(TEM)：650℃；霧化氣(gas1)：40 psi，加熱氣(gas2)：50 psi，簾氣(CUR)：25 psi。
　　結(jié)果：通過與對(duì)照品的保留時(shí)間、分子量和質(zhì)譜數(shù)據(jù)比較，分別對(duì)8個(gè)已知五環(huán)三萜化合物色譜峰進(jìn)行歸屬?；衔?，10，14，18，20，21，35和36分別鑒定為白頭翁皂苷B4，白頭翁皂苷C，23-羥基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸-3-O-[吡喃鼠

12、李糖基-吡喃阿拉伯糖基]-28-O-[吡喃葡萄糖酯苷]，白頭翁皂苷B，23-羥基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸-3-O-[吡喃阿拉伯糖基]-28-O-[吡喃葡萄糖酯苷]，常春藤皂苷元28-O-[吡喃葡萄糖基.吡喃葡萄糖酯苷]，白頭翁皂苷A3和常春藤皂苷。同時(shí)，通過由對(duì)照品裂解行為總結(jié)得出的規(guī)律推斷出了29個(gè)五環(huán)三萜皂苷類化合物的結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)首次建立了利用HPLC-ESI-MS聯(lián)用技術(shù)分析白頭翁中五環(huán)三萜皂苷類成分的

13、方法。本法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，成功用于白頭翁中五環(huán)三萜皂苷類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定。通過聯(lián)合MRM-IDA-EPI和PREC-IDA-EPI掃描模式對(duì)化合物結(jié)構(gòu)分析方面具有明顯優(yōu)越性，對(duì)控制中藥材質(zhì)量具有重要意義。
　　第四部分 HPLC-MS法同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中4種五環(huán)三萜皂苷類成分及其藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究
　　目的：建立HPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中白頭翁提取物4個(gè)五環(huán)三萜皂苷類化合物(白頭翁皂苷B4，白頭翁皂苷B，白頭

14、翁皂苷A3和23-羥基白樺脂酸)的分析方法，并計(jì)算其在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。
　　方法：血漿樣品采用了Strata-X固相萃取柱預(yù)處理，采用Sapphire C18(250 mm×4.6 mm，5μm)色譜柱；以A(甲醇含0.1％甲酸)-B(0.1％甲酸水溶液)為流動(dòng)相，梯度洗脫程序?yàn)椋?-6 min，75-95% A；6-15 min，保持95%A不變，預(yù)平衡時(shí)間為6 min，流速為800μL·min-1。色譜柱后溶液全部進(jìn)入離

15、子源，無分流，分析時(shí)間為15 min。質(zhì)譜以電噴霧離子源進(jìn)行正離子模式和負(fù)離子模式檢測(cè)，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，并首次應(yīng)用了多次切換檢測(cè)模式。白頭翁皂苷B4，白頭翁皂苷B，白頭翁皂苷A3，23-羥基白樺脂酸和內(nèi)標(biāo)的監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為m/z1219.7/749.4，m/z819.4/347.2，m/z749.6/471.2，m/z471.4/471.4和m/z461.1/285.0。本研究將4種五環(huán)三萜皂苷類成分和內(nèi)標(biāo)化合物的檢測(cè)過程劃分為5個(gè)

16、階段：0.0-6.998 min，內(nèi)標(biāo)和白頭翁皂苷B4在負(fù)離子模式下監(jiān)測(cè)；6.998-7.028min，負(fù)離子掃描模式被切換至正離子掃描模式；7.028-10.027 min，正離子模式下監(jiān)測(cè)白頭翁皂苷B；10.027-10.057 min，正離子掃描模式被切換至負(fù)離子掃描模式；10.057-15.059min，負(fù)離子模式下監(jiān)測(cè)白頭翁皂苷A3和23-羥基白樺脂酸。
　　結(jié)果：4種五環(huán)三萜皂苷類成分在大鼠血漿中專屬性、線性、準(zhǔn)確度、

17、精密度、提取回收率和基質(zhì)回收率均被驗(yàn)證。4種待測(cè)化合物的線性關(guān)系良好(r2>0.99)；日內(nèi)、日間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于9%；在室溫儲(chǔ)存24 h，5次凍融和-20℃儲(chǔ)存30天的條件下各待測(cè)化合物的穩(wěn)定性良好，準(zhǔn)確度在-6.82%-6.18%之間；高、中、低三個(gè)濃度水平的平均提取回收率分別為82.16%-104.5%；基質(zhì)效應(yīng)均值在77.69%-108.2%之間。
　　結(jié)論：該方法特異、快速、靈敏，結(jié)合固相萃取的預(yù)處理

18、方法和HPLC-MS的新檢測(cè)手段對(duì)白頭翁中4種五環(huán)三萜皂苷類化合物進(jìn)行了藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。本研究中首次應(yīng)用了多次切換檢測(cè)模式，并首次在五環(huán)三萜皂苷類化合物體內(nèi)測(cè)定時(shí)采用了Strata-X固相小柱進(jìn)行生物樣品預(yù)處理。此方法為五環(huán)三萜皂苷類化合物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究提供了一個(gè)新的思路。
　　第五部分液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定大鼠膽汁中6種五環(huán)三萜皂苷類成分及其排泄動(dòng)力學(xué)研究
　　目的：建立一種可同時(shí)測(cè)定大鼠膽汁中6種主要五環(huán)三萜皂苷類化

19、合物(白頭翁皂苷B4，刺人參苷S，白頭翁皂苷C，白頭翁皂苷B，白頭翁皂苷A3和23-羥基白樺脂酸)含量的HPLC-MS方法，并用于大鼠灌胃給予白頭翁提取物后其6種待測(cè)化合物的膽汁排泄動(dòng)力學(xué)研究。
　　方法：色譜柱為Sapphire-C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；柱溫為25℃：流動(dòng)相為(0.1%甲酸)甲醇A-0.1%甲酸水溶液B，梯度洗脫，洗脫程序如下：0.0-6.0 min，75-95% A；6.0-15.0 m

20、in，保持95% A；進(jìn)樣前預(yù)平衡6 min。流速為800μL·min-1。色譜柱后溶液全部進(jìn)入離子源，無分流，進(jìn)樣量為10μL。電噴霧離子源(ESI源)，Turbo V離子源，源溫度為650℃。源噴射電壓為5500 V和-4500 V，源內(nèi)氣體1(Gasl，N2)壓力：40 psi；氣體2(Gas2，N2)壓力：50psi；氣簾氣體(N2)壓力：25 psi；正負(fù)離子分別檢測(cè)模式；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；碰撞氣(CAD，N2

21、)壓力為medium；Q1分辨率為UNIT，Q3分辨率為UNIT。SD大鼠8只，隨機(jī)分成2組。其中2只為空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組6只大鼠灌胃給予白頭翁提取物(10 mL·kg-1)后，收集給藥后0-1 h，1-3 h，3-5 h，5-7 h，7-9 h，9-12 h和12-24 h時(shí)間段的膽汁并測(cè)定體積。測(cè)定大鼠灌胃給予白頭翁提取物后膽汁中6種五環(huán)三萜皂苷類化合物的累積排泄率。
　　結(jié)果：大鼠膽汁中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾6種待測(cè)化合物和內(nèi)標(biāo)的

22、測(cè)定；6種五環(huán)三萜皂苷類成分標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.9973；日內(nèi)RSD和日間RSD分別小于9.1%和9.0%，RE在-9.5%到9.2%之間；提取回收率的范圍為80.03%～115.6%；基質(zhì)效應(yīng)的范圍為78.43%～109.7%。
　　結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，可滿足大鼠膽汁中微量五環(huán)三萜類皂苷成分的測(cè)定要求。待測(cè)6種五環(huán)三萜皂苷類化合物在1～3 h內(nèi)排泄率最高，在3～5 h時(shí)間段時(shí)略有減少，隨著

23、時(shí)間的推移，排泄率逐漸降低，并趨于平緩。結(jié)果表明，只有不到14%的待測(cè)物以原型從膽汁排泄，結(jié)果表明其五環(huán)三萜皂苷類化合物在體內(nèi)可能存在某種生物轉(zhuǎn)化和體內(nèi)代謝。
　　第六部分白樺脂酸血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定
　　目的：建立白樺脂酸在大鼠血漿、人血漿和牛血清白蛋白中蛋白結(jié)合率的測(cè)定方法。
　　方法：采用平衡透析法測(cè)定白樺脂酸血漿蛋白結(jié)合率，利用HPLC法測(cè)定血漿中白樺脂酸濃度，測(cè)定并比較不同血漿中白樺脂酸的血漿蛋白結(jié)合率。

24、>　　結(jié)果：在50～100μg/mL，藥物濃度對(duì)血漿蛋白結(jié)合率無顯著影響，白樺脂酸與大鼠和人的血漿蛋白結(jié)合率存在顯著性差異，白樺脂酸與人血漿蛋白結(jié)合率高于與大鼠血漿蛋白結(jié)合率。
　　結(jié)論：白樺脂酸與血漿蛋白具有較強(qiáng)的結(jié)合，且在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度范圍內(nèi)蛋白結(jié)合率與透析液中藥物濃度無關(guān)。只有少量游離藥物作為活性藥物分子參與體內(nèi)藥物處置，從而產(chǎn)生藥理效應(yīng)。
　　第七部分白樺脂酸大鼠在體腸吸收動(dòng)力學(xué)研究
　　目的：建立同時(shí)測(cè)定腸循

25、環(huán)液中白樺脂酸和酚紅濃度的HPLC-DAD法，并探討白樺脂酸在大鼠各腸段的吸收動(dòng)力學(xué)特征及不同藥物濃度對(duì)吸收的影響。
　　方法：采用大鼠在體腸吸收實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并考察吸收部位、藥物濃度和pH值對(duì)藥物吸收的影響。色譜柱為Diamonsil ODS C18色譜柱(250mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.2%乙酸(75:25)；流速1.0 mL·min-1；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm(白樺脂酸)和430 nm(酚紅)；進(jìn)

26、樣量20μL。
　　結(jié)果：在75～125μg·mL-1內(nèi)白樺脂酸的吸收速率與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，Ka值基本保持不變；各腸段的吸收速率無顯著性差異，十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的Ka值分別為(0.151±0.0049)，(0.156±0.0056)，(0.149±0.0083)，(0.159±0.0041)h-1。
　　結(jié)論：白樺脂酸在小腸中吸收良好，沒有特定吸收部位；不同濃度對(duì)白樺脂酸在大鼠全腸道的吸收無顯著影響，其在腸道的吸