不同PKC亞型對KCNQ1通道蛋白表達的調(diào)節(jié)作用及機制.pdf

1、延遲整流鉀電流（IK）是哺乳動物和人的心室肌細胞動作電位復(fù)極主要的外向鉀電流，按照通道動力學(xué)特征將IK區(qū)分為快激活（IKr）和緩慢激活I(lǐng)Ks）兩種成分。其中，IKs通道的孔區(qū)α-亞單位由KCNQ1基因編碼、β-亞單位由KCNE1基因編碼?，F(xiàn)已明確，先天性KCNQ1和KCNE1基因突變可致IKs增大或減小，分別引發(fā)長QT綜合征（LQT）和短QT綜合征（SQT）。心臟疾病如心肌缺血、心肌肥厚、慢性心力衰竭等均伴隨IKs的減小，表現(xiàn)為獲得性L

2、QT。LQT和SQT均以高發(fā)室性心律失常為特征。因此，研究KCNQ1/KCNE1通道的功能調(diào)節(jié)具有重要意義。
　　越來越多的證據(jù)表明，催化磷酸化反應(yīng)的蛋白磷酸激酶C（PKC）家族與KCNQ1/KCNE1通道的功能調(diào)控相關(guān)，但迄今關(guān)于PKC對IKs的調(diào)節(jié)報道不盡相同，有增加和減小兩種相反的結(jié)果。已知PKC家族按照結(jié)構(gòu)和激活方式的不同可以分為傳統(tǒng)型PKC（cPKC，包括α、βI、βII和γ），新型PKC（nPKC，包括δ、ε、π和θ）

3、和非典型PKC（aPKC，包括ζ、ι/λ）三大類，而不同動物種屬的心肌組織均存在PKCα、βI、βII、θ、δ、γ等亞型。很可能上述PKC對IKs的不同調(diào)節(jié)現(xiàn)象是因為激活的PKC亞型不同所致。離子通道電流的大小取決于通道孔的通透性、開放概率以及細胞膜上通道數(shù)量，調(diào)節(jié)后者的因素涉及基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、轉(zhuǎn)運以及降解等環(huán)節(jié)。其中蛋白的正向轉(zhuǎn)運與降解平衡是決定細胞膜上通道數(shù)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前，不同PKC亞型如何調(diào)控細胞膜通道蛋白轉(zhuǎn)運與降解從而影

4、響細胞膜上通道數(shù)量尚不清楚。
　　因此，本研究主要在分子生物學(xué)水平，利用非選擇性PKC激動劑和連接透膜序列的選擇性PKC激動肽，在異源表達系統(tǒng)上研究不同PKC亞型對細胞膜上KCNQ1表達水平的調(diào)節(jié)作用，并且探究其調(diào)節(jié)作用的機制。這對理解心肌離子通道的病理重構(gòu)機制具重要意義，也將為發(fā)現(xiàn)以PKC亞型為靶點的新型抗心律失常藥物提供重要的理論依據(jù)。
　　第一部分不同PKC亞型對KCNQ1蛋白表達調(diào)節(jié)作用。
　　目的：在構(gòu)建的穩(wěn)

5、定表達KCNQ1/KCNE1通道的HEK293細胞系上，研究不同PKC亞型對KCNQ1總蛋白、細胞膜蛋白表達水平的影響。
　　方法：
　　1.全細胞蛋白提?。杭毎春筝p輕刮下并離心，收集細胞沉淀，按照RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑（PMSF）以100:1的比例加入并使細胞沉淀充分混懸，冰上超聲破碎后靜置裂解，離心收集上清液。
　　2.細胞膜蛋白提?。豪蒙锼仵；姆椒擞浖毎さ鞍?，充分裂解破碎細胞后，借助珠子特異性

6、結(jié)合的方式將生物素標記的膜蛋白分離，其余成份離心丟棄，再經(jīng)洗脫，得到純凈的細胞膜蛋白成份。
　　3.Western blot：對提取的全細胞蛋白或者細胞膜蛋白進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用TBST配制含10％脫脂奶粉的封閉液進行封閉，通過特異性的一抗與紅外熒光標記的二抗結(jié)合，用ODYSSEY雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器進行曝光成像。
　　4.siRNA瞬時轉(zhuǎn)染：采用Lipofectin RNAmax試劑

7、盒進行瞬時轉(zhuǎn)染，鋪板后24小時，細胞匯合度達到50%-60%時可進行siRNA的瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染4小時左右后換完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，siRNA表達完成，可進行下一步處理。
　　結(jié)果：
　　1.不同PKC亞型對全細胞KCNQ1蛋白表達水平的影響：利用非選擇性PKC激動劑PMA（100 nM）、OAG（10μM）和選擇性cPKC激動肽（200 nM）、PKCε激動肽（200 nM）分別孵育24小時，Western blo

8、t檢測全細胞KCNQ1蛋白表達沒有明顯變化。
　　2.不同PKC亞型對細胞膜KCNQ1蛋白表達水平的影響：首先，驗證細胞膜蛋白提取方法的敏感性。采用陽性對照藥地塞米松（50 nM）（已被證實通過抑制蛋白泛素化降解，顯著增加細胞膜KCNQ1蛋白表達水平）孵育6、24小時后，與對照組相比，細胞膜KCNQ1蛋白表達水平分別是對照的176%和281%，證明實驗所用的細胞膜蛋白提取方法敏感性較好。
　　PMA、OAG以及cPKC激動肽

9、、PKCε激動肽分別與細胞孵育6、24小時，Western blot檢測細胞膜KCNQ1蛋白表達水平。結(jié)果顯示，PMA孵育后細胞膜KCNQ1蛋白表達水平分別是對照的36%和24%；cPKC激動肽孵育后，細胞膜KCNQ1蛋白表達水平分別是對照的24%和30%；PKCε激動肽孵育后細胞膜KCNQ1蛋白表達水平是對照的34%和34%；而OAG孵育后，細胞膜KCNQ1蛋白表達水平?jīng)]有明顯變化。
　　3.siRNA敲低不同PKC亞型對激動肽

10、作用的影響：利用siRNA干擾技術(shù)，敲低不同PKC亞型表達，觀察對上述PKC亞型激動肽作用的影響，進一步驗證其作用的特異性。結(jié)果顯示，敲低細胞PKC和β亞型可逆轉(zhuǎn)cPKC激動肽下調(diào)細胞膜KCNQ1蛋白表達的作用，未敲低為對照的48%，而敲低PKC和β亞型后為對照的94%。與此相似，敲低PKCε亞型后PKCε激動肽對細胞膜KCNQ1蛋白表達的下調(diào)作用顯著減弱，未敲低為對照的33%，而敲低PKCε亞型后為對照的68%。因此，實驗進一步表明P

11、KC亞型特異性調(diào)節(jié)細胞膜KCNQ1蛋白表達的作用。
　　小結(jié)：在異源表達系統(tǒng)上， PMA、cPKC和PKCε激動肽對全細胞KCNQ1蛋白表達無明顯影響，而對細胞膜KCNQ1蛋白表達均呈現(xiàn)明顯下調(diào)作用，提示PKC通過調(diào)節(jié)通道的轉(zhuǎn)運與降解過程影響細胞膜上的通道表達水平。
　　第二部分不同PKC亞型對細胞膜KCNQ1表達調(diào)節(jié)作用的機制
　　目的：探究激活cPKC亞型和PKCε亞型后下調(diào)細胞膜KCNQ1蛋白表達的調(diào)節(jié)作用機制。

12、
　　方法：觀察選擇性干擾細胞膜通道蛋白內(nèi)吞、降解和正向轉(zhuǎn)運過程的工具藥對PKC亞型激動肽作用的影響，分析激活不同PKC亞型對上述過程的調(diào)節(jié)作用。細胞膜蛋白提取和Western blot方法同第一部分。
　　結(jié)果：
　　1.對細胞膜蛋白內(nèi)吞過程影響：觀察內(nèi)吞抑制劑Dynasore（80μM）對激活不同PKC亞型作用的影響。結(jié)果顯示，PMA與Dynasore共同孵育6小時后對細胞膜KCNQ1蛋白表達的下調(diào)作用被明顯抑制，

13、單獨孵育表達水平為對照的34%，而共同孵育為對照的89%；與此相似，cPKC激動肽與Dynasore共同孵育對細胞膜KCNQ1蛋白表達的下調(diào)作用同樣被明顯抑制，單獨孵育表達水平為對照的24%，而共同孵育為對照的89%。上述結(jié)果表明PMA和cPKC激動肽通過促進馬達蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑使細胞膜KCNQ1蛋白加速降解而發(fā)揮下調(diào)作用。與此相反，PKCε激動肽與Dynasore共同孵育對KCNQ1細胞膜蛋白表達的下調(diào)作用未受影響，單獨孵育表達水平

14、為對照的29%，而共同孵育表達水平為對照的39%，提示PKCε激動肽并非通過影響內(nèi)吞過程減少細胞膜KCNQ1表達水平。此外，單獨孵育Dynasore并不明顯改變細胞膜KCNQ1蛋白表達水平，可能是其他代償?shù)姆绞綇浹a了馬達蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑阻斷所帶來的影響。
　　2.對細胞膜蛋白降解的影響：加入正向轉(zhuǎn)運阻斷劑Brefeldin A（BFA）（10μM）后利用Western blot檢測不同時間細胞膜上KCNQ1蛋白表達水平，可以反映

15、出通道細胞膜蛋白降解速度。結(jié)果顯示，以各自0小時細胞膜KCNQ1蛋白表達水平為100%，BFA對照組孵育6、24小時分別是0小時的72%和39%，cPKC激動肽共孵育分別是30%和14%，與對照相比降解顯著增多；而PKCε激動肽共孵育分別是68%和33%，降解程度與對照相比無明顯差別。結(jié)果進一步驗證了激活cPKC亞型通過加速內(nèi)吞降解過程下調(diào)細胞膜KCNQ1蛋白表達水平，而激活PKCε亞型對細胞膜KCNQ1蛋白表達的下調(diào)作用則可能是通過抑

16、制蛋白正向轉(zhuǎn)運或者再循環(huán)過程而實現(xiàn)的。與此類似，也觀察了PMA對蛋白降解的影響。結(jié)果顯示，BFA對照組孵育后細胞膜KCNQ1蛋白表達水平分別是0小時的82%和32%，而PMA共孵育分別是45%和14%，兩個時間點的降解程度均顯著高于對照，表明PMA也通過加速內(nèi)吞降解過程來下調(diào)細胞膜KCNQ1蛋白表達水平。結(jié)果提示盡管PMA為非選擇性PKC激動劑，但其作用機制與cPKC亞型相似，可能在此實驗系統(tǒng)PMA主要通過激活cPKC亞型下調(diào)細胞膜KC