棉花葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建以及轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、通過細胞核遺傳工程的研究，對棉花產(chǎn)量提高和品質(zhì)改進以及抗病蟲害起到了積極作用，但細胞核遺傳工程仍存在諸如基因失活、基因沉默、位置效應(yīng)、花粉漂移及多基因轉(zhuǎn)化困難等弊端，而葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)作為一種新興的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)有望克服核基因轉(zhuǎn)化帶來的諸多不足，該技術(shù)的成功應(yīng)用將會給棉花基因工程帶來一次新的革命。為了解決棉花細胞核遺傳工程所帶來的諸多問題，開展了棉花葉綠體轉(zhuǎn)基因的研究，構(gòu)建棉花葉綠體轉(zhuǎn)化載體；嘗試建立棉花葉綠體轉(zhuǎn)化的標準程序。
　　

2、 根據(jù)已發(fā)表的棉花葉綠體基因組序列（NC_007944）設(shè)計引物，用PCR方法擴增獲得兩段同源序列LHRR和RHRR，并通過酶切連接與質(zhì)粒pBluesript SK連接構(gòu)建出載體pBSKRR；同時用PCR方法擴增報告基因gfp及篩選標記nptⅡ基因，并在這兩個基因兩端分別加上來自于棉花葉綠體基因組的強啟動子Prrn和PpsbA以及起穩(wěn)定作用的3’UTR莖環(huán)結(jié)構(gòu)Trps16和TpsbA，構(gòu)建出含有Prrn-gfp-Trps16和PpsbA

3、-nptⅡ-TpsbA表達盒的載體pGGPT和pGNPT；再將這兩個基因表達盒與載體pBSKRR酶切連接構(gòu)建出載體pBRGN，并初步應(yīng)用于棉花和煙草的葉綠體轉(zhuǎn)化，獲得了具有卡那霉素抗性的煙草的綠色愈傷及幼苗，PCR檢測出gfp基因和nptⅡ基因的條帶，并在熒光顯微鏡下檢測到gfp的表達。gfp在棉花胚性愈傷中也有少量表達，但表達情況很不理想，需要對轉(zhuǎn)化受體以及再生條件進行進一步的摸索。
　　 盡管葉綠體轉(zhuǎn)化在棉花中還存在著很多問