活血消癭方治療結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的臨床經(jīng)驗及調(diào)控PI3K-Akt信號通路的機制研究.pdf

1、目的：通過中醫(yī)理論研究，提高臨床辨治結(jié)節(jié)性甲狀腺腫水平；通過對活血消癭方臨床應用經(jīng)驗的研究，提高臨床應用能力；通過活血消癭方對PI3K/Akt信號通路的調(diào)控機制研究，探索其作用的具體靶點。
　　方法：（1）理論探討：通過查閱古今文獻，對結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的中醫(yī)病名、病因病機、治療進行了總結(jié)，特別是對痰血瘀阻這一重要病機進行了系統(tǒng)研究。
　?。?）活血消癭方臨床應用經(jīng)驗研究：從其組方、各藥藥效、藥物學、制作工藝、臨床應用規(guī)律等方面

2、進行了總結(jié)。
　?。?）實驗研究：將SPF級SD雄性大鼠60只，隨機分為6組，于SPF級實驗室中分籠、恒溫、恒濕飼養(yǎng)。適應性飼養(yǎng)2周后，予0.1％的PTU溶液灌胃造模8周。自第9周始，給予藥物灌胃4周。4周后，腹腔注射麻醉：心臟取血，分離血清，使用 Elisa法檢測血清 TGF-α水平；分離甲狀腺組織：取左側(cè)甲狀腺一部分用于制作石蠟切片及行TUNEL法檢測細胞凋亡，一部分用于行qRT-PCR檢測PI3KmRNA、AktmRNA及m

3、TORmRNA表達水平；取右側(cè)甲狀腺行Western-Blot檢測PTEN、EGFR、ERK1/2、BAX、CyclinD1、FOXO3a蛋白表達情況，收集數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果：(1)理論研究：甲狀腺實性結(jié)節(jié)可以用“癭結(jié)”命名，以甲狀腺結(jié)節(jié)為主要表現(xiàn)的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫可以用“結(jié)癭”命名。
　　正氣虧虛是結(jié)節(jié)性甲狀腺腫發(fā)生的內(nèi)因，情志失調(diào)是其發(fā)生的誘因，飲食起居失常是其高發(fā)的重要原因，痰瘀貫穿于其整個病程之中，是其重

4、要的病理環(huán)節(jié)，也是導致其遷延難愈及復發(fā)的潛在因素。
　　痰血瘀阻在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中既有痰瘀同病的一般特點，也具有其自身特點，臨床主要表現(xiàn)為：甲狀腺腫大、甲狀腺局部疼痛、甲狀腺結(jié)節(jié)等。在不同病證中的表現(xiàn)不同，在繼發(fā)或并發(fā)癥中的表現(xiàn)不同，病情輕重不同、表現(xiàn)也不同。
　　結(jié)節(jié)性甲狀腺腫痰血瘀阻主要有以下幾種形式：肝郁氣滯，痰瘀互阻；火毒熾盛，痰凝血瘀；脾虛失運，痰滯血瘀；陰虛火旺，痰結(jié)瘀阻；陽虛寒凝，痰瘀內(nèi)生。
　　在治療時

5、需：明確痰瘀的主次、輕重及層次；以調(diào)氣暢志為先；注意飲食宜忌、慎起居；注意兼癥的治療；隨癥配伍；內(nèi)外合治、慢病緩圖；防變防復。
　　從痰瘀論治結(jié)節(jié)性甲狀腺腫有八大治法：理氣化痰活血、活血化痰消癭、清熱化痰活血、健脾化痰活血、養(yǎng)陰化痰活血、溫陽化痰活血、化痰活血軟堅、宣肺化痰散結(jié)，臨床需針對具體的疾病進行具體分析，靈活運用。
　　(2)活血消癭方對病程小于6個月、低回聲、囊性、邊界清楚、無血供或低血供、結(jié)節(jié)最大直徑小于3厘米的

6、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫結(jié)節(jié)效果較好，療程以3-6個月為宜。
　　(3)在組織病理學方面：模型組可見：濾泡腫脹，大小差異明顯，小部分融合成大泡，大部分變??；上皮排列多不規(guī)則，由單層上皮發(fā)展為復層上皮，濾泡上皮內(nèi)伸形成乳頭狀的復雜結(jié)構(gòu)；局部濾泡增生明顯，形成團塊，周圍血管豐富，表明結(jié)甲模型復制成功。藥物干預后：濾泡腫脹減小，內(nèi)部乳頭狀結(jié)構(gòu)減少，周圍增生減少，血管生成減少，上皮細胞排列較為規(guī)則，且隨著活血消癭方濃度的增加改善愈加明顯。
　

7、　(4)甲狀腺細胞凋亡指數(shù)（TUNEL法）檢測顯示：模型對照組凋亡指數(shù)顯著降低，與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），說明在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫大鼠模型中存在抵抗凋亡現(xiàn)象。與模型對照組相比，西藥組及活血消癭方干預組，各大鼠甲狀腺組織的凋亡指數(shù)均顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。西藥干預組與中藥干預組比較：西藥組與活血消癭方高劑量組凋亡指數(shù)無統(tǒng)計學差異（P>0.05），而明顯高于活血消癭方低、中劑量組，差異具有統(tǒng)計

8、學意義（P<0.01）?；钛`方各劑量組之間比較：呈現(xiàn)劑量依耐性變化，即凋亡指數(shù)：高劑量組>中劑量組>低劑量組，差異具有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。
　　(5)qRT-PCR法檢測各組大鼠甲狀腺mRNA表達顯示：與空白對照組相比，模型對照組PI3KmRNA、AktmRNA及mTORmRNA的表達量均升高，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01），說明在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫大鼠模型中存在PI3K/Akt信號通路的異常激活。與模型對照組相比

9、，活血消癭方中、高劑量組PI3KmRN、AktmRNA及mTORmRNA的表達量均有所下降，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）；西藥干預組及活血消癭方低劑量組變化均不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。西藥干預組與中藥干預組相比：西藥干預組與活血消癭方低劑量組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與活血消癭方中、高劑量組差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。中藥各干預組之間比較：高劑量組優(yōu)于中劑量組，中劑量組優(yōu)于低劑量組，差異具有

10、顯著統(tǒng)計學差異（P<0.01）。
　　(6)Western-Blot法檢測大鼠甲狀腺組織相關(guān)蛋白表達顯示：與空白對照組相比，模型對照組PTEN、BAX及FOXO3a蛋白的表達量均降低，差異具有顯著性統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型對照組相比：活血消癭方中、高劑量干預組PTEN、BAX及FOXO3a蛋白表達量均有所上升，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）；活血消癭方低劑量組與西藥干預組PTEN、BAX及FOXO3a蛋白表達量無

11、明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。西藥干預組與中藥干預組相比：西藥組與活血消癭方低劑量組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與活血消癭方中、高劑量組差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。中藥各干預組之間比較：高劑量組優(yōu)于中劑量組，中劑量組優(yōu)于低劑量組，差異具有顯著性統(tǒng)計學差異（P<0.01）。
　　與空白對照組相比：模型對照組EGFR、ERK1/2及CyclinD1蛋白的表達量均升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

12、與模型對照組相比：活血消癭方中、高劑量組EGFR、ERK1/2及CyclinD1蛋白表達量均下降，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）；西藥干預組及活血消癭方低劑量組下降不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。西藥干預組與中藥干預組相比：西藥干預組與活血消癭方低劑量組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與活血消癭方中、高劑量組差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。中藥各干預組之間比較：高劑量組優(yōu)于中劑量組，中劑量組優(yōu)于低劑量組，差異

13、具有顯
　　著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　(7)Elisa法檢測大鼠血清 TGF-α顯示：與空白對照組相比，模型對照組血清 TGF-α升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型對照組相比：活血消癭方中、高劑量干預組血清 TGF-α均下降，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）；西藥干預組及活血消癭方低劑量組下降不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。西藥干預組與中藥干預組相比：西藥干預組與活血消癭方低劑量組差異

14、無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與活血消癭方中、高劑量組差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。中藥各干預組之間比較：高劑量組優(yōu)于中劑量組，中劑量組優(yōu)于低劑量組，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　結(jié)論：(1)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中醫(yī)理論體系完善，痰血瘀阻的病機理論對于臨床論治具有重大的指導意義；
　　(2)活血消癭方理法方藥完備，工藝完善，特色明顯，值得進一步推廣應用；
　　(3)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫模型大鼠存在凋亡抵抗

15、現(xiàn)象，而P13K/Akt信號通路的激活可能是其抵抗凋亡的具體機制之一；
　　(4)活血消癭方可通過調(diào)控 P13K/Akt信號通路相關(guān)基因及蛋白的表達而誘導凋亡、抑制增殖，進而發(fā)揮治療及防治惡變的作用，具體機制為：通過升高PTEN蛋白的表達，防止結(jié)節(jié)惡變；升高血清TGF-α水平，繼而激活EGFR的表達，抑制PI3K/Akt信號通路激活，上調(diào)FOXO3a蛋白的表達，抑制CyclinD1的活性，延緩細胞生長，抑制增殖；促進BAX蛋白表達