大腦突觸體蛋白質(zhì)差異表達(dá)和相互作用分析.pdf

1、哺乳動(dòng)物大腦是信息處理中心以及各種生理活動(dòng)和行為的控制中心。突觸是大腦神經(jīng)元之間發(fā)生功能聯(lián)系的部位，許多與突觸功能有關(guān)的生理生化過程如神經(jīng)遞質(zhì)釋放與激活、神經(jīng)遞質(zhì)受體的調(diào)節(jié)以及信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)放大等都是由突觸中構(gòu)成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的突觸蛋白相互協(xié)調(diào)完成的。因此，深入開展突觸蛋白及其相互作用和突觸蛋白在不同生理病理?xiàng)l件下的差異表達(dá)研究將有助于進(jìn)一步了解突觸的結(jié)構(gòu)與功能。本論文研究主要利用蛋白質(zhì)組學(xué)及相關(guān)技術(shù)研究哺乳動(dòng)物大腦突觸中與突觸傳遞有關(guān)的蛋白質(zhì)

2、相互作用和突觸蛋白在終末糖基化產(chǎn)物累積過程中的差異表達(dá)，以發(fā)現(xiàn)和鑒定新的與特定受體和離子通道相互作用的蛋白，從而加深對(duì)突觸傳遞分子機(jī)制的了解。
　　 已有證據(jù)表明，給C57 BL/6小鼠注射高劑量的半乳糖會(huì)導(dǎo)致終末糖基化產(chǎn)物(AGEs)的累積，從而引發(fā)糖尿病以及糖尿病并發(fā)癥。如，糖尿病神經(jīng)病變是糖尿病并發(fā)癥中的一種，該疾病能使病人的學(xué)習(xí)能力和記憶能力減弱。學(xué)習(xí)和記憶能力減弱的根源在于突觸蛋白以及蛋白質(zhì)復(fù)合物的表達(dá)發(fā)生了改變。為了

3、探討AGEs誘導(dǎo)的突觸蛋白的差異表達(dá)，我們給C57 BL/6小鼠注射高劑量的半乳糖后采用blue native/SDS-PAGE結(jié)合iTRAQ標(biāo)記技術(shù)分析了小鼠大腦皮質(zhì)中差異表達(dá)的突觸蛋白。發(fā)現(xiàn)84個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平在AGEs累積過程中發(fā)生了變化。這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)主要涉及神經(jīng)遞質(zhì)釋放、能量代謝以及信號(hào)傳導(dǎo)等過程，說明在AGEs累積過程中，能量代謝和神經(jīng)信號(hào)傳遞過程被削弱。闡明AGEs累積導(dǎo)致的差異表達(dá)蛋白有助于我們了解糖尿病神經(jīng)病變

4、中學(xué)習(xí)和記憶能力減弱的分子機(jī)制并為治療這些疾病提供參考。
　　 突觸結(jié)合蛋白Ⅰ是突觸囊泡膜上一種與Ca2+調(diào)控的胞吐作用有關(guān)的重要蛋白質(zhì)，能感受鈣內(nèi)流并引發(fā)囊泡的融合和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。盡管有很多關(guān)于這個(gè)蛋白質(zhì)的研究，但目前對(duì)于突觸結(jié)合蛋白Ⅰ在突觸傳遞過程中的具體功能和作用機(jī)制仍不很清楚。突觸結(jié)合蛋白Ⅰ分子中特異蛋白質(zhì)互作結(jié)構(gòu)域的存在使人們推測(cè)它們可能與多種涉及突觸傳遞的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。本研究在鑒定能與突觸結(jié)合蛋白Ⅰ

5、結(jié)合的可能的新蛋白時(shí)，通過blue native PAGE發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的能與突觸結(jié)合蛋白I相互作用的低分子量GTP結(jié)合蛋白一Rab3A，然后利用大鼠突觸質(zhì)膜蛋白提取物用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Rab3A能以不依賴于Ca2+的方式與突觸結(jié)合蛋白Ⅰ產(chǎn)生很強(qiáng)的相互作用。通過定點(diǎn)突變和GST pull down實(shí)驗(yàn)對(duì)突觸結(jié)合蛋白Ⅰ中Rab3A的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)突觸結(jié)合蛋白工分子中C2B結(jié)構(gòu)域的KKKK模體為Rab3A結(jié)合所必需；肌酸6磷酸能

6、調(diào)節(jié)Rab3A與突觸結(jié)合蛋白Ⅰ的結(jié)合。鑒于Rab3A能抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放且與tSNAREs復(fù)合物(突觸融合蛋白/SNAP-25)中的突觸融合蛋白在突觸結(jié)合蛋白Ⅰ中的結(jié)合位點(diǎn)相同，推測(cè)Rab3A可能與突觸融合蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合突觸結(jié)合蛋白Ⅰ分子中的相同位點(diǎn)，通過影響突觸結(jié)合蛋白Ⅰ與突觸融合蛋白/SNAP-25復(fù)合物的相互作用而達(dá)到抑制膜融合和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的目的。我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這一推測(cè)。本部分研究證實(shí)，Rab3A是突觸結(jié)合蛋白Ⅰ的一

7、種新的相互作用蛋白，它們間的直接相互作用在突觸傳遞的膜融合調(diào)節(jié)中起著十分重要的作用。研究結(jié)果加深了我們對(duì)突觸傳遞調(diào)控機(jī)制的了解。
　　 電壓門控鉀離子通道Kv1.4是突觸前膜中一種重要的A型鉀離子通道，此通道能調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的興奮性。Kv1.4在膜上的表達(dá)、定位、通道動(dòng)力學(xué)以及翻譯后修飾等都受其相互作用蛋白的調(diào)控。盡管已有一些關(guān)于Kv1.4相互作用蛋白研究的報(bào)道，但仍有很多問題有待解決。本研究通過免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜等技術(shù)

8、發(fā)現(xiàn)突觸結(jié)合蛋白Ⅰ能與突觸前膜的Kv1.4蛋白形成天然復(fù)合物，表明突觸結(jié)合蛋白Ⅰ是Kv1.4的相互作用蛋白。用突觸結(jié)合蛋白Ⅰ特異的抗體能使Kv1.4蛋白共沉淀進(jìn)一步證明了這一結(jié)論。免疫組化實(shí)驗(yàn)表明，突觸結(jié)合蛋白Ⅰ和Kv1.4蛋白在海馬的CA3區(qū)具有共定位。此外，我們利用膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)突觸結(jié)合蛋白Ⅰ能延緩HEK293T細(xì)胞中Kv1.4的失活，但不影響其激活動(dòng)力學(xué)；突觸結(jié)合蛋白Ⅰ與Kv1.4的結(jié)合依賴于Ca2+的存在。實(shí)驗(yàn)證明突觸結(jié)合蛋白Ⅰ