蛋白質(zhì)相互作用

1、Protein-protein Interaction 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,03/27/2009,Protein-Protein Interactions- A Common Theme in Cell Biology 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的普遍主題,* DNA

2、 * RNA * Protein,Cell assembly and function/細(xì)胞組裝與功能,,Messenger,Headquarter,Executor,Stable, DNA mutation,Stable/Versatile, rRNA, tRNA, mRNA,Versatile, Protein modificationProtein

3、-Protein interactionProtein-Other component interaction,Protein-Protein Interactions,Single protein Protein complex Protein complex interaction

4、 Protein complex network Cell, Versatile, Dynamic, Accurate regulation……,Cell assembly and function,Protein-Protein Interactions,Interaction Domain

5、 - Structural basis for protein interaction 相互作用區(qū)域是蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),* 信號(hào)蛋白，調(diào)節(jié)蛋白以及大多數(shù)其他的蛋白質(zhì)都具 有包括相互作用區(qū)域在內(nèi)的好幾個(gè)結(jié)構(gòu)域； * 有些多肽僅由相互作用區(qū)域組成，從而充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)復(fù)合物的核心。,Interaction Domain - Structural basis for protein interaction 相互作

6、用區(qū)域是蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),*SH2 domain: phosphotyrosine-containing peptides recognition domain。SH2 分布最為廣泛，識(shí)別特定的含有磷酸化Tyr的多肽模塊。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,SH3,SH2,Y kinase,SH3,SH2,SH3,,,,pYEEI,,,pYVNV,Src SH2 domain:

7、 Grb2 SH2 domain:,Interaction domain and Protein interactionSignaling transduction pathway,Physiological functions of protein interactions Localization 蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位,*蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位與其 功能密切相關(guān)；* 涉

8、及： 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用； 蛋白質(zhì)與磷脂的相互作用；* 蛋白質(zhì)的組織特異性與 亞細(xì)胞定位的研究是蛋白 質(zhì)功能研究的起始步驟,Protein-protein interaction can be used to build complex biological systems. 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是功能復(fù)合物形成的基礎(chǔ)。 （如線粒體內(nèi)膜呼吸鏈）,Physiological function

9、s of protein interactionsLocalization and Trafficking,Aberrant interactions can contribute to pathogenesis; 錯(cuò)誤的相互作用可能導(dǎo)致病理形象的出現(xiàn)。 如 Alzheimer’s disease, beta-淀粉樣結(jié)構(gòu)的堆積；,Physiological functions of protein inte

10、ractionsLocalization and Trafficking,Inducible protein interaction & posttranslational modifications可誘導(dǎo)的蛋白相互作用與翻譯后修飾,Dynamic behavior of cells in response to changing conditions is highly depend

11、ent on posttranslational modifications; 細(xì)胞面對(duì)不斷改變的環(huán)境表現(xiàn)出來(lái)的動(dòng)態(tài)行為有賴于蛋白質(zhì)的翻譯后修飾以及它帶來(lái)的蛋白質(zhì)相互作用的變化。,Techniques and computation,Elucidation of Protein-Protein Interactions,Biophysical TechniquesMass SpectrometrySurface Plas

12、mon Resonance Atomic Force MicroscopyNMRX-ray Crystallography,High Throughput TechniquesLibrary ScreeningDegenerate Peptide LibrariesSpot BlotsCo-IPsGST-pulldownsYeast 2-HybridPhage Display,Standard Techniques

13、Co-IPsGST-pull downsYeast 2-HybridPhage Display,In vivo ImagingFRETBRET,,,,,,Protein Interaction Networks,Techniques：Principle, Process, Advantage and DisadvantageGST-Pull down,Principle: Affinity purification

14、 Affinity between Interaction motif /polypeptide and its interaction proteins;Advantage: Direct interaction / In vitroProcess:,Interaction motif,GST,,Immobilized onGlutathione beads,,,Affinity column

15、Making,,Affinity purificationfrom tissue or cell lysate,Techniques： 免疫沉淀,,,質(zhì)量作用定律決定IP的成功度,,Techniques： 免疫沉淀（非變性）,,免疫沉淀的靈敏度取決于Protein A (or G) 與 IgG的Kd、IgG與抗原的Kd值。所以增加抗原或抗體的濃度、使用與抗體直接共價(jià)偶聯(lián)的珠子進(jìn)行免疫沉淀可以

16、提高靈敏度；,,Protein A Bead,IgG,Antigen,,Kd,Kd,*,*,,IgG,Kd,,,Antigen,Co-Immunoprecipitation /共免疫沉淀,Principle: Affinity purification/ 親和純化Advantage: In vivo (Physiological status) / 代表生理狀態(tài)下的相互作用,,X,Y,,,,,X,Y,Cell,C

17、ell Lysis andImmunoprecipitation of protein X,Z,Z,,細(xì)胞裂解與蛋白質(zhì)X的免疫沉淀,Techniques： 免疫沉淀（非變性）,,生理活性的保持： a. 全程低溫操作； b. 裂解液中加入蛋白酶抑制劑；2. 免疫沉淀的靈敏度取決于Protein A(or G) 與 IgG的Kd、IgG與抗原的Kd值。 所以增加抗原或抗體的濃度、使用與抗體直

18、接共價(jià)偶聯(lián)的珠子進(jìn)行免疫沉 淀可以提高靈敏度；,,Protein A Bead,IgG,X,,Kd,Kd,*,*,,IgG,X,Kd,,,Techniques： 免疫沉淀（非變性）,,免疫沉淀的產(chǎn)物如用于SDS-PAGE及及免疫印跡進(jìn)一步分析時(shí)， * 需要去除鹽的干擾，PBS 或其它洗滌緩沖液應(yīng)可能去除； 大量IgG摻入也影響電泳的效果，如脫尾和擴(kuò)散。 檢測(cè)信號(hào)十

19、分微弱時(shí)，這種條帶的擴(kuò)散可能導(dǎo)致根本無(wú)法獲得 信息；,,,Techniques： 免疫沉淀（非變性）,,免疫沉淀的產(chǎn)物如用于SDS-PAGE及及免疫印跡進(jìn)一步分析時(shí)，大量的IgG摻入樣品后導(dǎo)致免疫印跡時(shí)出現(xiàn)非特異性條帶；對(duì)免疫共沉淀的結(jié)果分析影響尤其大；,,IgG,,目的蛋白,用目的蛋白的抗體進(jìn)行 免疫沉淀，再用免疫印 跡法進(jìn)行檢測(cè)；,,GFP,WT,YF Mut(6),- +,- +,-

20、 +,,IP: GFPIB: 4G10 (pTyr),,MTSS1-GFP,,GFP,,PDGF,115,93,49.8,35.8,29.2,198,,,,,,,- +,- +,- +,,,,,,,,,,,,,,,,,,Reblot: GFP,MTSS1-GFP,GFP,WT,YF Mut(6),Techniques： 免疫共沉淀（非變性）,,操作同非變性免疫沉淀，只是檢測(cè)的是相互作用蛋白；其效率還涉

21、及復(fù)合物中蛋白質(zhì)X，Y，Z的Kd 值。,,Protein A Bead,IgG,,,,,X,Y,Z,Protein A IgG Protein X* Protein Y Protein Z,,,,,Kd,Kd,Kd,Kd,Techniques： 免疫共沉淀（非變性）,,1. 免疫復(fù)合物中蛋白質(zhì)X， Y，Z的Kd 值越小，即越穩(wěn)定， 有利于免疫共沉淀的進(jìn)行;2. 免疫沉淀中提高

22、靈敏度的方法同樣適用于免疫共沉淀；,X,Y,Z,Protein A IgG Protein X* Protein Y Protein Z,,,,,Kd,Kd,Kd,Kd,,Techniques： 免疫共沉淀（非變性）,,細(xì)胞裂解液的幾點(diǎn)考慮：1. 復(fù)合物的穩(wěn)定，提高靈敏度，但會(huì)降低特異性；2. 針對(duì)特定的復(fù)合物，細(xì)胞裂解液中可能加入磷酸酯酶 抑制劑或者ATP及一些金屬離子以維持復(fù)合物的

23、穩(wěn)定；,Techniques： 免疫共沉淀,免疫共沉淀中的非特異性：,,,,B,,A,x,,Y,細(xì)胞裂解,蛋白質(zhì)X的抗體進(jìn)行免疫沉淀,,,,,X,Y,,,,X,Y,,B,,,,,A,,X,Techniques： 免疫共沉淀： 基于免疫共沉淀中非特異性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮（類型 I）,,,,,B,,A,x,,Y,細(xì)胞裂解,蛋白質(zhì)X的抗體進(jìn)行免疫沉淀,,,,,,A,X,原因：抗體的非特異性,Techniques：

24、免疫共沉淀： 基于免疫共沉淀中非特異性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮（類型I）,1.抗體的質(zhì)量：抗體的特異性；2.盡可能的設(shè)置多種陰性對(duì)照； 一般采用兔子免疫前的血清(pre-immune serum) 同時(shí)進(jìn)行免疫沉淀及后續(xù)分析;3.使用目標(biāo)蛋白的多種抗體進(jìn)行免疫沉淀并比較；4.采用不表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞裂解物同時(shí)進(jìn)行免疫 沉淀并比較；5.增強(qiáng)細(xì)胞裂解液的嚴(yán)謹(jǐn)性，降低非特異性；6.檢測(cè)兩種蛋白質(zhì)的相互作用時(shí)，同時(shí)用兩個(gè)蛋白

25、質(zhì)的抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；,,,,,B,,A,x,,Y,細(xì)胞裂解,蛋白質(zhì)X的抗體進(jìn)行免疫沉淀,,,,,X,Y,,,,X,Y,,B,X,Techniques： 免疫共沉淀： 基于免疫共沉淀中非特異性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮（類型 II）,抗原復(fù)合物與其它蛋白質(zhì)的非特異性相互作用；抗原復(fù)合物解離,,,,X,,Techniques： 免疫共沉淀： 基于免疫共沉淀中非特異性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮（類型 II）,* 當(dāng) X-Y 的復(fù)合物不很穩(wěn)定或解離常數(shù)大時(shí)，

26、可以考慮使用細(xì)胞 可滲透的交聯(lián)劑(Cross-linker),,X,,NH2,Y,NH2,,活性基團(tuán),活性基團(tuán),A,°,,,,B,,A,x,,Y,細(xì)胞裂解,蛋白質(zhì)X的抗體進(jìn)行免疫沉淀,,,Techniques： 免疫共沉淀： 基于免疫共沉淀中非特異性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮（類型 II）,* 當(dāng) X-Y 的復(fù)合物是瞬間形成的或解離常數(shù)大時(shí)，可以考慮 使用細(xì)胞可滲透的交聯(lián)劑(Cross-linker),,X,,NH2,Y

27、,NH2,,活性基團(tuán),活性基團(tuán),A,°,,,,,,,B,,A,x,,Y,細(xì)胞裂解,蛋白質(zhì)X的抗體進(jìn)行免疫沉淀,,,,,X,Y,Techniques： 免疫共沉淀： 基于免疫共沉淀中非特異性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮（類型 II）,,,,,研究方案:Affinity purification & MS,,帶Tag的目標(biāo)蛋白與固相基質(zhì)偶聯(lián),目標(biāo)蛋白帶上Tag,目標(biāo)蛋白相互作用蛋白的親和純化,目標(biāo)蛋白復(fù)合物的SDS-PAGE分離

28、,蛋白質(zhì)條帶的切割和酶解,質(zhì)譜與生物信息學(xué)分析,,,,,,,文獻(xiàn)與其他數(shù)據(jù)庫(kù)的功能分析,,實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與功能的探索,MTSS1 過(guò)量表達(dá)促進(jìn)PDGF誘導(dǎo)的背部變皺膜形成,,,GFP,MTSS1-GFP,F-actin,F-actin,GFP,GFP,研究方案:Co-immunoprecipitation & MS,,Serum starvation,MIM-GFP infected NIH 3T3 cell,PDGF stimul

29、ation,Crosslinker stabilize complex,Immunoprecipitation with GFP antibody,SDS-PAGE,Excise bands and digestion,Analyze by MS and bioinformatics,,,,,,,,核糖體蛋白代謝酶類熱休克蛋白泛肽酶高豐度的細(xì)胞骨架蛋白血清蛋白（如果使用是IP親和的方式）,MS after affinity p

30、urification鑒定結(jié)果中通常包含很多非特異的蛋白質(zhì)信息,去除這些常見(jiàn)的非特異結(jié)合的蛋白質(zhì)（除非它們與你目標(biāo) 蛋白質(zhì)功能相關(guān)）,,Transcriptional pattern of of MTSS1 and interacting protein candidates identified by Co-IP & MS,http://mouse.brain-map.org/,*利用其他數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的功能分析,質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)

31、的分類（Example）,F-actin affinity purification & MS 鑒定小腦發(fā)育相關(guān)的F-actin binding protein;Step: (1) F-actin 親和純化； (2) MS 數(shù)據(jù)搜索和初步分析； (3) 按鑒定到的蛋白質(zhì)與F-actin結(jié)合的屬性分類; (4) 按MS鑒定到的蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能分類； (5) 生物學(xué)功能相同或相近的蛋白質(zhì)聚類, 分析

32、復(fù)合物組成； (6) 根據(jù)這些蛋白質(zhì)在小腦不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式聚類； (7) 由此將與小腦發(fā)育相關(guān)的F-actin 結(jié)合蛋白與小腦特定發(fā)育 時(shí)期的功能相聯(lián)系。,部分鑒定到的F-actin 結(jié)合蛋白的功能歸屬,,,,Proliferation & Cell death,Cell migration & differentiation,Dendrogenesis & axogenesis

33、,Synaptogenesis,Postnatal development stages of cerebellum,Transcription level of MTSS1 in cerebellum,*,*,蛋白質(zhì)功能研究的策略,信息學(xué),試驗(yàn)分析,,,新蛋白,,,序列同源比較,,相互作用區(qū)域,,功能區(qū),功能伙伴的預(yù)測(cè),,,,為抗體、siRNA,shRNA等的設(shè)計(jì)提供預(yù)測(cè),試驗(yàn)工具：抗體，克隆，siRNA, shRNA,,,生

34、理學(xué)背景：內(nèi)源表達(dá)和組織及細(xì)胞定位,,,篩選相關(guān)蛋白,,,驗(yàn)證相關(guān)蛋白：1. 細(xì)胞內(nèi)共定位；2. 去除相互作用區(qū)域的影響；3. 新蛋白與相關(guān)蛋白在功能上的一致性；,,,從找到的新相關(guān)蛋白開(kāi)始，進(jìn)行新一輪的篩選，建立功能 網(wǎng)絡(luò),,,,PRD,WH2,CCD,,,Y397,Y398,,,,,,,,,,,,IMD domainF-actin bindingRac binding,,,,,,,Cortactin

35、binding,G-actinbinding,Src SH2 binding,,,,利用信息學(xué)分析新蛋白的結(jié)構(gòu)和功能區(qū)，并進(jìn)行相互作用蛋白的預(yù)測(cè),,,,,,Yamagishi et al, J Biol Chem, 279, 14929, 2004;Mattila et al, J Biol Chem, 278, 8452,2003;Bompard et al, J Cell Sci, 118, 5393, 2005.Lin

36、 et al, Oncogene,24, 2059,2005.,利用亞細(xì)胞定位及蛋白質(zhì)相互作用等信息進(jìn)行蛋白質(zhì)功能歸屬,例 1：從免疫共沉淀中得到的蛋白質(zhì)中篩選重要功能相關(guān)蛋白：利用免疫共沉淀方法找到的9個(gè)p53(胞漿和核定位） 結(jié)合蛋白 1. GRP-94 GRP-94 2. Alpha-actinin 1 GRP-78 分子伴侶

37、 *** 3. MCM3 GRP-75 4. GRP-78 5. GRP-75 2 MCM3 DNA復(fù)制準(zhǔn)許因子** 6. Lamin A/C 7. Ezrin/Cytovillin

38、 Alpha-actinin 胞漿 8. CD98 antigen 3 Lamin A/C 核纖層 細(xì)胞骨架 ？ 9. Protein kinase C Ezrin/cytovilin 胞漿 4 Protein Kinase C

39、 激酶 ？ 5 CD98 antigen 跨膜糖蛋白 X,,,,,1,,例3 Sra1與Nap1參與Rac誘導(dǎo)的片狀偽足形成,從牛腦中用傳統(tǒng)的柱層析分離到的蛋白質(zhì)復(fù)合物，組分 經(jīng)質(zhì)譜鑒定，包括Nap1,Sra-1 homologue，PIR121, WAVE1 and Abi等組分。,免疫共沉淀與GST-Pull down驗(yàn)證Rac活