野薔薇苷對(duì)抗急性低壓缺氧大鼠骨組織損傷作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：急性高原疾病，通常又稱為急性高山?。ˋMS），是在急進(jìn)高原人群中常見和多發(fā)的一類疾病，其病因是由于急速進(jìn)入高海拔的低氧環(huán)境所造成的人體多組織器官的病理性損傷和功能學(xué)紊亂。近年的研究表明，利用多種藥物防治手段可有效減少AMS的發(fā)病人數(shù)，并降低其致殘率與致死率。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，從藏藥蕨麻中提取的有效單體成分“野薔薇苷（Rosamultin）”，在體外多種細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)中，具有對(duì)抗缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的藥理活性。在前期研究基礎(chǔ)上，本課題通

2、過建立大鼠急性低壓缺氧損傷模型，模擬人體急進(jìn)高原引起的低氧損傷，觀察急性低壓缺氧環(huán)境對(duì)大鼠骨組織的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能的影響，并通過缺氧前進(jìn)行多濃度梯度的藥物干預(yù)，研究單體藥物“野薔薇苷”對(duì)抗急性高原低壓缺氧大鼠骨組織損傷的藥理作用，通過檢測大鼠骨組織中成骨細(xì)胞的活性及其骨形成功能、破骨細(xì)胞的活性及其骨吸收功能，深入探討“野薔薇苷”抗缺氧性骨損傷作用的可能機(jī)制，以及為新型抗高原缺氧藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：

3、　　1、實(shí)驗(yàn)分組
　　選用60只體重為（200±20）g的雄性SD實(shí)驗(yàn)大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表的方法，將其分作以下5個(gè)實(shí)驗(yàn)組：正常平原對(duì)照組（C組）、急性高原低氧模型組（M組）、野薔薇苷高劑量組（15 mg/kg）（H組）、野薔薇苷低劑量組（5 mg/kg）（L組）、地塞米松陽性藥組（0.36 mg/kg）（D組），每組12只大鼠。
　　2、急性高原低氧模型的建立
　　采用數(shù)字化控制的低壓缺氧艙（設(shè)置相應(yīng)的溫度和濕度），通

4、過快速連續(xù)的抽真空處理，使艙內(nèi)負(fù)壓達(dá)到模擬海拔的真空度（7000 m海拔，持續(xù)18 h），從而建立大鼠急性高原低壓缺氧損傷模型，并在缺氧處理前進(jìn)行各劑量藥物的干預(yù)，同時(shí)將正常平原對(duì)照組的大鼠置于艙外同等溫、濕度條件下飼養(yǎng)。
　　3、采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）與生化反應(yīng)顯色法，測定各實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿與骨組織勻漿中的鈣（Ca）、磷（P）含量以及堿性磷酸酶（ALP）的活性。
　　4、通過常規(guī)的蘇木素-伊紅（HE）染色，觀察各組

5、大鼠骨組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)；通過特征性的ALP染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，觀察各組大鼠骨組織中成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的分化活性。
　　5、采用免疫組織化學(xué)染色法，測定各組大鼠骨組織中成骨標(biāo)志物“骨鈣素”（osteocalcin）、破骨標(biāo)志物“基質(zhì)金屬蛋白酶-9”（MMP-9）的表達(dá)水平，并觀察骨組織信號(hào)調(diào)控因子“骨保護(hù)素”（OPG）與“核因子κB受體活化因子配基”（RANKL）的表達(dá)情況。
　　6、利用Micro-CT機(jī)

6、（天津中醫(yī)藥大學(xué)分析測試中心提供），對(duì)各組大鼠股骨干骺端進(jìn)行連續(xù)掃描，經(jīng)三維重建成像后，計(jì)算一系列骨組織的微結(jié)構(gòu)指標(biāo)：包括骨組織密度（BMC）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁的分離度（Tb.Sp）以及骨小梁的數(shù)量（Tb.N）。
　　7、利用萬能力學(xué)加載試驗(yàn)機(jī)（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生裝備研究所提供），對(duì)各組大鼠股骨組織施加三點(diǎn)彎曲力學(xué)加載，觀察其斷裂時(shí)的力學(xué)特性指標(biāo)：包括骨組織的斷裂彎曲應(yīng)力、斷裂彎曲應(yīng)變及斷裂位移，并計(jì)算各組大鼠骨組

7、織的彈性模量。
　　結(jié)果：
　　1、血鈣濃度檢測結(jié)果
　　相比于正常平原對(duì)照組，模擬急性高原缺氧后大鼠的血鈣濃度并無顯著性改變；而相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預(yù)后大鼠的血鈣濃度顯著升高（P<0.01），陽性藥物地塞米松干預(yù)后大鼠的血鈣濃度也顯著升高（P<0.01）。
　　2、血磷濃度檢測結(jié)果
　　相比于正常平原對(duì)照組，模擬急性高原缺氧后大鼠的血磷濃度顯著升高（P<0.01）；而相比于急性高

8、原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預(yù)后大鼠的血磷濃度顯著下降（P<0.01或P<0.05），陽性藥物地塞米松干預(yù)后大鼠的血磷濃度也顯著下降（P<0.01）。
　　3、血ALP檢測結(jié)果
　　相比于正常平原對(duì)照組，模擬急性高原缺氧后大鼠血漿中ALP活性無顯著性改變；而相比于急性高原低氧模型組，高劑量野薔薇苷干預(yù)后大鼠血漿中ALP活性無顯著性改變，低劑量野薔薇苷干預(yù)后大鼠血漿中ALP活性顯著升高（P<0.05），陽性藥物地塞米松干

9、預(yù)后大鼠血漿中ALP活性無顯著性改變。
　　4、骨鈣檢測結(jié)果
　　相比于正常平原對(duì)照組，模擬急性高原缺氧后大鼠的骨鈣濃度并無顯著性改變；而相比于急性高原低氧模型組，經(jīng)高、低劑量野薔薇苷、陽性藥物地塞米松干預(yù)后，大鼠的骨鈣濃度也均無顯著性改變。
　　5、骨磷檢測結(jié)果
　　相比于正常平原對(duì)照組，模擬急性高原缺氧后大鼠的骨磷濃度并無顯著性改變；相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預(yù)后大鼠的骨磷濃度也無顯著性改

10、變，而陽性藥物地塞米松干預(yù)后大鼠的骨磷濃度顯著下降（P<0.01）。
　　6、骨源性ALP檢測結(jié)果
　　相比于正常平原對(duì)照組，模擬急性高原缺氧后大鼠骨源性ALP活性顯著下降（P<0.01）；而相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預(yù)后大鼠骨源性ALP活性顯著升高（P<0.01或P<0.05），陽性藥物地塞米松干預(yù)后大鼠骨源性ALP活性也顯著升高（P<0.05）。
　　7、 HE染色結(jié)果
　　在正常大鼠的股

11、骨組織中，可見骨小梁邊緣平整光滑，骨小梁排列連續(xù)、緊密，骨小梁分離度較??；相比于正常平原對(duì)照組，模擬急性高原缺氧后大鼠股骨組織的骨小梁邊緣粗糙，骨小梁間隙增大，骨小梁排列不齊且有斷點(diǎn)，骨髓腔內(nèi)炎性細(xì)胞增多；而相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預(yù)后大鼠股骨組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)均有顯著改善，陽性藥物地塞米松干預(yù)后大鼠股骨組織的形態(tài)、結(jié)構(gòu)也有明顯改善。
　　8、 ALP染色結(jié)果
　　在正常大鼠的股骨組織中，可見ALP染色呈

12、粉紅色，色調(diào)均勻且清晰；相比于正常平原對(duì)照組，模擬急性高原缺氧后大鼠股骨組織中ALP染色強(qiáng)度降低，色調(diào)變淺；而相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預(yù)后大鼠股骨組織中ALP染色強(qiáng)度顯著升高，其中高劑量野薔薇苷組ALP染色的色調(diào)最強(qiáng)，陽性藥物地塞米松干預(yù)后大鼠股骨組織中ALP染色強(qiáng)度也有明顯升高。
　　9、 TRAP染色結(jié)果
　　在正常大鼠的股骨組織中，較少見到成熟的破骨細(xì)胞（呈紫紅色的多核巨細(xì)胞）；相比于正常平原對(duì)照

13、組，模擬急性高原缺氧后大鼠股骨組織中破骨細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，且多為成熟的分化形態(tài)；而相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預(yù)后大鼠股骨組織中分化成熟的破骨細(xì)胞顯著減少，陽性藥物地塞米松干預(yù)后大鼠股骨組織中破骨細(xì)胞的分化數(shù)量和程度也顯著下降。
　　10、 osteocalcin免疫染色結(jié)果
　　相比于正常平原對(duì)照組，模擬急性高原缺氧后大鼠骨組織中osteocalcin的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）；而相比于急性高原

14、低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預(yù)后大鼠骨組織中osteocalcin的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），陽性藥物地塞米松干預(yù)后大鼠骨組織中osteocalcin的表達(dá)水平也顯著升高（P<0.01）。
　　11、 MMP-9免疫染色結(jié)果
　　相比于正常平原對(duì)照組，模擬急性高原缺氧后大鼠骨組織中MMP-9的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；而相比于急性高原低氧模型組，高劑量野薔薇苷干預(yù)后大鼠骨組織中MMP-9的表達(dá)水平顯著降低

15、（P<0.05），陽性藥物地塞米松干預(yù)后大鼠骨組織中MMP-9的表達(dá)水平也顯著降低（P<0.05）。
　　12、 OPG免疫染色結(jié)果
　　相比于正常平原對(duì)照組，模擬急性高原缺氧后大鼠骨組織中OPG的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；而相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預(yù)后大鼠骨組織中OPG的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），陽性藥物地塞米松干預(yù)后大鼠骨組織中OPG的表達(dá)水平也顯著升高（P<0.01）。
　　

16、13、 RANKL免疫染色結(jié)果
　　相比于正常平原對(duì)照組，模擬急性高原缺氧后大鼠骨組織中RANKL的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）；而相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預(yù)后大鼠骨組織中 RANKL的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），陽性藥物地塞米松干預(yù)后大鼠骨組織中RANKL的表達(dá)水平也顯著降低（P<0.05）。
　　14、 Micro-CT檢測結(jié)果
　　相比于正常平原對(duì)照組，模擬急性高原缺氧后大鼠股骨干

17、骺端的骨小梁數(shù)量顯著減少（P<0.05）；而相比于急性高原低氧模型組，高劑量野薔薇苷干預(yù)后大鼠股骨干骺端的骨小梁數(shù)量顯著增加（P<0.01），低劑量野薔薇苷及地塞米松干預(yù)后大鼠股骨的骨小梁數(shù)量無顯著性改變。
　　相比于正常平原對(duì)照組，模擬急性高原缺氧后大鼠股骨干骺端的骨小梁分離度顯著增大（P<0.05）；而相比于急性高原低氧模型組，高劑量野薔薇苷干預(yù)后大鼠股骨干骺端的骨小梁分離度顯著減?。≒<0.01），低劑量野薔薇苷及地塞米松干

18、預(yù)后大鼠股骨的骨小梁分離度無顯著性改變。
　　15、骨力學(xué)特性檢測結(jié)果
　　相比于正常平原對(duì)照組，模擬急性高原缺氧后大鼠股骨的斷裂彎曲應(yīng)力顯著下降（P<0.01）；而相比于急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預(yù)后大鼠股骨的斷裂彎曲應(yīng)力顯著升高（P<0.05），陽性藥物地塞米松干預(yù)后大鼠股骨的斷裂彎曲應(yīng)力也顯著升高（P<0.05）。
　　相比正常平原對(duì)照組，模擬急性高原缺氧后大鼠股骨的彈性模量顯著下降（P<0.01）

19、；而相比急性高原低氧模型組，高、低劑量野薔薇苷干預(yù)后大鼠股骨的彈性模量顯著升高（P<0.05或P<0.01），陽性藥物地塞米松干預(yù)后大鼠股骨的彈性模量顯著升高（P<0.01）。
　　結(jié)論：野薔薇苷具有明顯的對(duì)抗大鼠急性高原低壓缺氧性骨損傷的藥理活性，其機(jī)制可能是促進(jìn)缺氧骨組織中成骨細(xì)胞的分化活性，增強(qiáng)其骨形成功能，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞的分化活性，減弱其骨吸收功能，從而調(diào)節(jié)骨組織的骨重建過程，改善缺氧骨組織的結(jié)構(gòu)與功能，提高缺氧骨組織的