蛋白核心巖藻糖基化在原發(fā)性肝癌中的臨床意義及應用研究.pdf

1、原發(fā)性肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC），作為肝臟惡性腫瘤的一種，是臨床上原發(fā)性肝癌的主要形式，為世界五大常見惡性腫瘤之一，每年世界范圍內近25萬人死于肝癌，在全球腫瘤致死率中高居第三位。中國是肝癌大國，全球50％以上的新發(fā)和死亡肝癌患者發(fā)生在中國。流行病學及實驗研究資料表明，乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、黃曲霉素、酒精等是我國肝癌發(fā)病的主要病因。研究顯示，大部分肝癌患者都會經歷從肝炎

2、到肝硬化，最后進展到肝細胞癌的過程。目前，肝癌的五年生存率仍不到10％。由于肝癌起病隱匿，發(fā)病時多數(shù)患者已處于肝癌晚期，失去了治療的機會。因此，肝癌的早期診斷尤為重要。目前，組織活檢和病理檢查是肝癌診斷的“金標準”，然而由于其有創(chuàng)性，臨床應用有限。血清甲胎蛋白（AFP）自上世紀60年代發(fā)現(xiàn)后逐漸應用于臨床，作為迄今為止臨床診斷HCC的首選指標，AFP的診斷靈敏度只有約60％，在一些非肝癌疾病如肝臟良性疾病、炎癥反應時也可見其升高，其診斷

3、效果同樣不能讓人滿意。
　　肝癌的起病及進展由多個蛋白分子參與，是一個復雜的生物學過程，而研究表明血中過半的蛋白分子都存在糖基化現(xiàn)象。AFP-L3，即核心巖藻糖基化的甲胎蛋白早在2005年就已被美國食品藥品管理局(FDA)采納應用于臨床。研究發(fā)生特定糖基化改變的蛋白與肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的關系對于肝病的診治及預后都具有十分重要的作用。與此同時，近年來的定量蛋白質組學也取得了巨大的技術進步，以質譜為基礎的定量蛋白質組學越來越多地被應用于

4、臨床。本課題將圍繞血清中發(fā)生核心巖藻糖基化改變的蛋白，從兩個方面探討核心巖藻糖基化蛋白在原發(fā)性肝細胞癌中的臨床意義。
　　第一部分:凝集素親和富集尋找血清中的原發(fā)性肝癌差異糖蛋白
　　本研究對收集的健康對照(Healthy control，HC)、肝硬化(Liver cirrhosis，LC)及原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)患者的血清差異核心巖藻糖基化蛋白進行篩選。LCA可與核心巖

5、藻糖基化聚糖發(fā)生特異性結合親和富集HC、LC及HCC人群血清蛋白，利用質譜技術尋找三組間差異蛋白。通過先初篩再驗證的策略，旨在綜合不同質譜技術差異，篩選核心巖藻糖基化差異蛋白。利用orbitrap質譜分析檢測并進行三組樣本間差異蛋白分析;隨后擴大樣本，采用兩種不同的質譜方法對初篩結果進行驗證，并對兩種不同質譜方法差異展開分析討論。結果:綜合初篩及兩種不同質譜方法的驗證結果，LC與HC組間的差異蛋白為:血清淀粉樣組分P(Serum amy

6、loid p-component)，孕區(qū)蛋白(Pregnancyzone protein)，觸珠蛋白相關蛋白(Haptoglobin-related protein)，核心巖藻糖基化的三種蛋白HC組水平顯著高于LC組;HCC與HC組間的差異蛋白為性激素結合蛋白(Sex hormone binding protein)、多聚免疫球蛋白受體(Polymeric immunoglobulin receptor)，核心巖藻糖基化的兩種蛋白在HC

7、C組水平顯著高于HC組;HCC與LC組間的差異蛋白包括血清淀粉樣組分P(Serum amyloid p-component)，觸珠蛋白(Haptoglobin)，甲狀腺素運載蛋白(Transthyretin)及載脂蛋白L1(Apolipoprotein L1)，四種核心巖藻糖基化蛋白在HCC組水平均顯著高于LC組。結論:本研究利用糖鏈與凝集素的結合特性，在親和純化的基礎上，利用高分辨率質譜技術從糖基化層面尋找肝癌、肝硬化的差異蛋白，本實

8、驗得到的差異糖基化蛋白中核心巖藻糖基化的血清淀粉樣組分P、孕區(qū)蛋白、觸珠蛋白相關蛋白可能具有鑒別診斷HC與LC的潛力;核心巖藻糖基化的性激素結合蛋白、多聚免疫球蛋白受體或可用于HCC與HC的鑒別診斷;核心巖藻糖基化的血清淀粉樣組分P、觸珠蛋白、甲狀腺素運載蛋白及載脂蛋白L1或具有鑒別診斷HCC與LC的潛在價值。這些發(fā)現(xiàn)均有待后續(xù)研究驗證。
　　第二部分:四種特定糖蛋白對HCC診斷及手術療效判斷意義分析
　　通過閱讀文獻及分析

9、臨床檢測的可及性，本研究對鐵蛋白（Ferritin，F(xiàn)er）、IgG、α2-M及轉鐵蛋白(Transferrin，Trf)這四種特定蛋白及其核心巖藻糖基化組分（以下簡稱為異質體）在原發(fā)性細胞癌中的診斷意義及其在肝細胞癌根治切除術前后的隨訪價值進行了初步探討。結果顯示Fer異質體％、α2-M、α2-M異質體％及Trf在HCC組與非HCC組間存在差異，其中α2-M、α2-M異質體％HCC組水平高于非HCC組。四種特定蛋白與AFP及AFP-L

10、3％相關性比較中，IgG異質體％、Trf異質體％均與AFP-L3％呈正相關。四種特定蛋白及其異質體％對HCC的診斷陽性率均不及目前臨床廣泛應用的AFP及AFP-L3％;四種特定蛋白中，只有α2-M及其異質體％對HCC診斷的AUC＞0.6(p＜0.05)。聯(lián)合檢測AFP、α2-M及α2-M異質體％可顯著提高對HCC的診斷價值，尤其是診斷靈敏度從單獨檢測AFP時的不足85％提升到90％。對四種特定蛋白與HCC腫瘤大小的相關研究顯示，HCC腫

11、瘤直徑與Trf-L3％正相關。在30例行肝癌根治性切除術的標本中，F(xiàn)er異質體、Fer異質體％、IgG、IgG異質體、Trf異質體在術前術后有顯著性差異，其中Fer異質體、Fer異質體％術后水平較術前降低。在HCC根治性切除術前術后AFP顯著下降組中，術后較術前顯著降低的指標有Fer異質體、Fer異質體％及IgG異質體％;在術前AFP陰性的術前術后配對標本中，α2-M異質體及α2-M異質體％水平在術后較術前顯著降低。結論:四科臨床常用的