對氧磷酶3在原發(fā)性肝癌中的表達、作用及臨床意義研究.pdf

1、根據(jù)最新流行病學調(diào)查，肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范圍內(nèi)高發(fā)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排名第五，病死率排名第二。肝癌的發(fā)生具有一定的地域聚集性，多發(fā)生于東亞、東南亞、北非和西非國家，而每年全世界約一半的新發(fā)和死亡病例是發(fā)生在中國。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的進步，肝癌的手術(shù)切除、肝移植、栓塞化療、射頻消融和抗病毒、生物治療方法已漸趨成熟并被綜合利用，但是肝癌患者的預后仍不理想，5年生存率僅約1

2、0％左右，且每年的發(fā)病率和死亡率基本持平。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的多步驟的過程，包括基因突變、染色體擴增或缺失、表觀遺傳變化等，期間涉及的分子調(diào)控網(wǎng)變化十分龐大且多樣，但是目前仍缺乏行之有效的診療靶點用以監(jiān)測疾病發(fā)生發(fā)展和改善患者的預后。因此，進一步完善肝癌發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控網(wǎng)研究，從中探求新的診療靶點對解決肝癌這一世界公共醫(yī)療難題具有重大而深遠的意義。
　　炎癥在促進肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，病毒感染、化學毒物侵害、自身

3、免疫和代謝性疾病等因素均可導致肝臟的慢性炎癥，并發(fā)展為肝硬化，最后轉(zhuǎn)變?yōu)楦伟?。持續(xù)的肝臟炎癥環(huán)境也是導致肝癌術(shù)后復發(fā)的主要因素之一。目前，已有以炎癥相關(guān)基因為作用靶點的藥物用于臨床某些腫瘤的預防和治療，例如長期服用以環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)1/2為作用靶點的非甾體類抗炎藥可明顯降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率。而肝癌作為一典型的炎癥相關(guān)性腫瘤，卻仍缺乏以炎癥相關(guān)性基因為作用靶點的靶向性藥物在臨床中應用，唯一被推薦用于晚期肝癌

4、治療的靶向性藥物索拉菲尼的作用靶點亦尚未明確。所以，進一步研究炎癥和肝癌的分子關(guān)聯(lián)，可以為尋找肝癌的診療靶點提供新的思路、途徑。
　　氧化應激和炎癥反應在多種疾病的發(fā)病過程中是相輔相成、相互促進的，慢性炎癥可以導致細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的堆積，而氧化應激的增強又可以增進炎癥的程度。對氧磷酶（paraoxonase，PON）家族是已知的具有重要抗炎和抗氧化活性的基因家族。該家族包括三個

5、成員，分別是PON1、PON2、PON3。三者彼此相鄰位于人類7號染色體長臂7q21.3-q22.1，并且在核苷酸和氨基酸水平具有高度相似性。已報道三者的表達量或活性與多種炎癥相關(guān)性疾病如心血管疾病、2型糖尿病、阿爾茲海默病和炎性腸病等呈負相關(guān)。但是，其在腫瘤中的作用目前研究甚少，在肝癌中未見研究報道，盡管已報道PON家族主要表達于肝臟組織。PON家族中，PON1和PON3主要表達于肝組織，PON3尚少量在腎組織表達，而PON2則廣泛表

6、達于人體各種組織中。PON1與極少量PON3被肝細胞分泌釋放入血，與高密度脂蛋白（highdensity lipoprotein，HDL）結(jié)合，抑制低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)氧化，在周圍血液循環(huán)中發(fā)揮抗炎、抗氧化效應。但是，研究表明正常生理狀態(tài)下PON3并不被分泌入血，而在某些病理性因素刺激下才少量分泌，其主要在細胞內(nèi)即肝細胞內(nèi)發(fā)揮抗炎、抗氧化作用。不僅如此，Draganovet等發(fā)現(xiàn)兔血清中

7、的PON3較PON1具有明顯較強的抗氧化效應。由此可見，在肝臟組織中，PON3較其他成員可能發(fā)揮著更為顯著的抗炎、抗氧化的作用，其可能影響肝癌的發(fā)生發(fā)展進程。因此，本研究對PON3在肝癌組織中的表達情況、臨床意義和其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用進行探索，以期為肝癌的診治、監(jiān)測提供新的靶點。
　　在本研究中，我們首先對我課題組前期已完成的表達譜芯片(GSE54238)進行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)隨著肝癌的發(fā)生發(fā)展進程“正常肝→慢性肝炎→肝硬化→早期

8、肝癌→晚期肝癌”，PON3的表達量發(fā)生明顯變化，并且肝癌組織中的表達量顯著低于癌旁肝組織(P＜0.0001)，提示我們PON3可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。收集臨床新鮮組織樣本，分別在兩個臨床隊列中檢測PON3在肝癌組織和對應癌旁肝組織中的mRNA和蛋白表達水平進一步證實了PON3的顯著差異表達。與臨床病理指標做相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)PON3與多個惡性臨床病理指標呈負相關(guān)，如肝癌分化分級(P＜0.001)、腫瘤直徑(P=0.008)、腫瘤

9、包膜(P=0.026)、血甲胎蛋白（fetal alpha protein，AFP）水平(P＜0.001)和早期復發(fā)(P=0.010)。進一步繪制Kaplan-Meier曲線和Log-rank檢驗顯示，PON3在肝癌組織中的表達量能夠有效預測肝癌患者特別是早期肝癌患者（TNM分期Ⅰ期）的預后，PON3低表達患者術(shù)后無瘤生存期（recurrence-free survival，RFS）和總生存期(overall survival，OS)顯

10、著縮短。在單因素分析的基礎上，對相關(guān)臨床病理指標進行多因素分析，發(fā)現(xiàn)PON3低表達是影響肝癌患者術(shù)后預后的獨立危險因素之一。小鼠皮下荷瘤實驗發(fā)現(xiàn)，干擾PON3顯著增強肝癌細胞在體內(nèi)的生長，過表達可明顯抑制肝癌生長。通過系列體外基因敲減和獲得功能實驗我們發(fā)現(xiàn)，PON3可以通過調(diào)控細胞增殖和細胞周期進程而影響肝癌細胞生長，但并不參與調(diào)控肝癌細胞凋亡。最后，我們通過構(gòu)建PON3敲減細胞系和其對照細胞系的細胞表達譜芯片，檢測PON3敲減后的細胞