對(duì)氧磷酶3在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)、作用及臨床意義研究.pdf

1、根據(jù)最新流行病學(xué)調(diào)查，肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范圍內(nèi)高發(fā)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排名第五，病死率排名第二。肝癌的發(fā)生具有一定的地域聚集性，多發(fā)生于東亞、東南亞、北非和西非國(guó)家，而每年全世界約一半的新發(fā)和死亡病例是發(fā)生在中國(guó)。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，肝癌的手術(shù)切除、肝移植、栓塞化療、射頻消融和抗病毒、生物治療方法已漸趨成熟并被綜合利用，但是肝癌患者的預(yù)后仍不理想，5年生存率僅約1

2、0％左右，且每年的發(fā)病率和死亡率基本持平。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多步驟的過(guò)程，包括基因突變、染色體擴(kuò)增或缺失、表觀遺傳變化等，期間涉及的分子調(diào)控網(wǎng)變化十分龐大且多樣，但是目前仍缺乏行之有效的診療靶點(diǎn)用以監(jiān)測(cè)疾病發(fā)生發(fā)展和改善患者的預(yù)后。因此，進(jìn)一步完善肝癌發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控網(wǎng)研究，從中探求新的診療靶點(diǎn)對(duì)解決肝癌這一世界公共醫(yī)療難題具有重大而深遠(yuǎn)的意義。
　　炎癥在促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，病毒感染、化學(xué)毒物侵害、自身

3、免疫和代謝性疾病等因素均可導(dǎo)致肝臟的慢性炎癥，并發(fā)展為肝硬化，最后轉(zhuǎn)變?yōu)楦伟?。持續(xù)的肝臟炎癥環(huán)境也是導(dǎo)致肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的主要因素之一。目前，已有以炎癥相關(guān)基因?yàn)樽饔冒悬c(diǎn)的藥物用于臨床某些腫瘤的預(yù)防和治療，例如長(zhǎng)期服用以環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)1/2為作用靶點(diǎn)的非甾體類(lèi)抗炎藥可明顯降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率。而肝癌作為一典型的炎癥相關(guān)性腫瘤，卻仍缺乏以炎癥相關(guān)性基因?yàn)樽饔冒悬c(diǎn)的靶向性藥物在臨床中應(yīng)用，唯一被推薦用于晚期肝癌

4、治療的靶向性藥物索拉菲尼的作用靶點(diǎn)亦尚未明確。所以，進(jìn)一步研究炎癥和肝癌的分子關(guān)聯(lián)，可以為尋找肝癌的診療靶點(diǎn)提供新的思路、途徑。
　　氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在多種疾病的發(fā)病過(guò)程中是相輔相成、相互促進(jìn)的，慢性炎癥可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的堆積，而氧化應(yīng)激的增強(qiáng)又可以增進(jìn)炎癥的程度。對(duì)氧磷酶（paraoxonase，PON）家族是已知的具有重要抗炎和抗氧化活性的基因家族。該家族包括三個(gè)

5、成員，分別是PON1、PON2、PON3。三者彼此相鄰位于人類(lèi)7號(hào)染色體長(zhǎng)臂7q21.3-q22.1，并且在核苷酸和氨基酸水平具有高度相似性。已報(bào)道三者的表達(dá)量或活性與多種炎癥相關(guān)性疾病如心血管疾病、2型糖尿病、阿爾茲海默病和炎性腸病等呈負(fù)相關(guān)。但是，其在腫瘤中的作用目前研究甚少，在肝癌中未見(jiàn)研究報(bào)道，盡管已報(bào)道PON家族主要表達(dá)于肝臟組織。PON家族中，PON1和PON3主要表達(dá)于肝組織，PON3尚少量在腎組織表達(dá)，而PON2則廣泛表

6、達(dá)于人體各種組織中。PON1與極少量PON3被肝細(xì)胞分泌釋放入血，與高密度脂蛋白（highdensity lipoprotein，HDL）結(jié)合，抑制低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)氧化，在周?chē)貉h(huán)中發(fā)揮抗炎、抗氧化效應(yīng)。但是，研究表明正常生理狀態(tài)下PON3并不被分泌入血，而在某些病理性因素刺激下才少量分泌，其主要在細(xì)胞內(nèi)即肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗炎、抗氧化作用。不僅如此，Draganovet等發(fā)現(xiàn)兔血清中

7、的PON3較PON1具有明顯較強(qiáng)的抗氧化效應(yīng)。由此可見(jiàn)，在肝臟組織中，PON3較其他成員可能發(fā)揮著更為顯著的抗炎、抗氧化的作用，其可能影響肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。因此，本研究對(duì)PON3在肝癌組織中的表達(dá)情況、臨床意義和其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行探索，以期為肝癌的診治、監(jiān)測(cè)提供新的靶點(diǎn)。
　　在本研究中，我們首先對(duì)我課題組前期已完成的表達(dá)譜芯片(GSE54238)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)隨著肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程“正常肝→慢性肝炎→肝硬化→早期

8、肝癌→晚期肝癌”，PON3的表達(dá)量發(fā)生明顯變化，并且肝癌組織中的表達(dá)量顯著低于癌旁肝組織(P＜0.0001)，提示我們PON3可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。收集臨床新鮮組織樣本，分別在兩個(gè)臨床隊(duì)列中檢測(cè)PON3在肝癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁肝組織中的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步證實(shí)了PON3的顯著差異表達(dá)。與臨床病理指標(biāo)做相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)PON3與多個(gè)惡性臨床病理指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，如肝癌分化分級(jí)(P＜0.001)、腫瘤直徑(P=0.008)、腫瘤

9、包膜(P=0.026)、血甲胎蛋白（fetal alpha protein，AFP）水平(P＜0.001)和早期復(fù)發(fā)(P=0.010)。進(jìn)一步繪制Kaplan-Meier曲線和Log-rank檢驗(yàn)顯示，PON3在肝癌組織中的表達(dá)量能夠有效預(yù)測(cè)肝癌患者特別是早期肝癌患者（TNM分期Ⅰ期）的預(yù)后，PON3低表達(dá)患者術(shù)后無(wú)瘤生存期（recurrence-free survival，RFS）和總生存期(overall survival，OS)顯

10、著縮短。在單因素分析的基礎(chǔ)上，對(duì)相關(guān)臨床病理指標(biāo)進(jìn)行多因素分析，發(fā)現(xiàn)PON3低表達(dá)是影響肝癌患者術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。小鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干擾PON3顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)，過(guò)表達(dá)可明顯抑制肝癌生長(zhǎng)。通過(guò)系列體外基因敲減和獲得功能實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，PON3可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程而影響肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，但并不參與調(diào)控肝癌細(xì)胞凋亡。最后，我們通過(guò)構(gòu)建PON3敲減細(xì)胞系和其對(duì)照細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)譜芯片，檢測(cè)PON3敲減后的細(xì)胞