MicroRNA-99a在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及作用機(jī)制.pdf

1、腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）在泌尿系統(tǒng)中是最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，它的生物學(xué)活動(dòng)極其復(fù)雜多變，發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制至今仍不明確。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)微小RNA-99a（miR-99a）在舌鱗狀細(xì)胞癌、漿膜卵巢癌、肝癌、鱗狀細(xì)胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌及兒童腎上腺皮質(zhì)腫瘤等多種腫瘤中的表達(dá)水平均下調(diào)，并且對(duì)這些腫瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，預(yù)示著miR-99a可能作為潛在的腫瘤抑制因子用于腫瘤的診斷與治療。基于

2、目前尚未有miR-99a在腎癌中的研究報(bào)道，本研究在腎癌組織標(biāo)本及腎癌細(xì)胞中檢測(cè)miR-99a的表達(dá)水平，分析miR-99a表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性，通過(guò)體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究miR-99a對(duì)腎癌細(xì)胞功能及腫瘤進(jìn)展的影響，檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)一步探討可能的作用機(jī)制，以期給腎癌的診斷和治療帶來(lái)新的思路。
　　第一部分 miR-99a在腎癌中的表達(dá)及臨床意義
　　目的：探討腎癌細(xì)胞系、腎癌組織及相應(yīng)癌旁組織中miR-99a的表達(dá)，并分析與

3、臨床特征的關(guān)系，探討腎細(xì)胞癌患者的臨床預(yù)后的關(guān)系。
　　方法：采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT–PCR）檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞株HK-2、腎癌細(xì)胞株786-0、腎癌細(xì)胞株OS-RC-2以及40例腎癌組織和相應(yīng)癌旁組織的miR-99a的表達(dá)水平，并對(duì)其進(jìn)行比較和相關(guān)分析。
　　結(jié)果：qRT-PCR結(jié)果顯

4、示786-0及OS-RC-2中miR-99a表達(dá)明顯低于HK-2，相對(duì)于癌旁組織，腎癌標(biāo)本中miR-99a表達(dá)明顯下調(diào)。Kaplan-Meier分析顯示，miR-99a表達(dá)水平降低的患者生存期顯著縮短。
　　結(jié)論：miR-99a在腎癌組織和細(xì)胞中明顯低表達(dá)，miR-99a表達(dá)水平下降的患者生存期明顯縮短，提示miR-99a可能成為腎癌診斷及預(yù)后的新標(biāo)志物。
　　第二部分 miR-99a對(duì)腎癌細(xì)胞功能及腫瘤進(jìn)展的影響
　

5、　目的：通過(guò)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)及裸鼠成瘤模型研究miR-99a對(duì)腎癌細(xì)胞功能及腫瘤進(jìn)展的影響。
　　方法：應(yīng)用合成的miR-99a模擬物轉(zhuǎn)染786-0及OS-RC-2，采用細(xì)胞增值檢測(cè)、克隆形成檢測(cè)、遷移檢測(cè)、侵襲檢測(cè)、流式細(xì)胞檢測(cè)，觀察上調(diào)miR-99a表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞功能及細(xì)胞周期的影響。裸鼠皮下注射786-0成瘤后再次注射miR-99a模擬物，觀察上調(diào)miR-99a表達(dá)對(duì)裸鼠成瘤的影響。
　　結(jié)果：細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染miR-

6、99a模擬物可對(duì)腎癌細(xì)胞的增殖、存活、遷移、侵襲起到抑制作用，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期的阻滯，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示注射miR-99a模擬物后腫瘤生長(zhǎng)明顯受抑制。
　　結(jié)論：miR-99a高表達(dá)可明顯抑制腎癌細(xì)胞功能及腫瘤進(jìn)展，提示miR-99a可能成為治療腎癌的有效調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。
　　第三部分 miR-99a調(diào)控腎癌進(jìn)展相關(guān)信號(hào)通路的機(jī)制研究
　　目的：檢測(cè)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamyc

7、in，mTOR）及其通路下游相關(guān)因子在腎細(xì)胞癌中受到miR-99a調(diào)控后的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討miR-99a通過(guò)mTOR信號(hào)通路抑制腫瘤進(jìn)展的機(jī)制。
　　方法：通過(guò)生物信息搜索miR-99a的靶基因。在HK-2、786-0及OS-RC-2中檢測(cè)mTOR的表達(dá)情況。miR-99a模擬物轉(zhuǎn)染786-0及OS-RC-2，檢測(cè)mTOR的表達(dá)水平變化。裸鼠皮下注射786-0成瘤后再次注射miR-99a模擬物，檢測(cè)腫瘤組織中mTOR的表達(dá)水平

8、變化。miR-99a的靶基因通過(guò)熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。miR-99a模擬物轉(zhuǎn)染786-0，檢測(cè)mTOR信號(hào)通路相關(guān)因子及下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化。mTOR-siRNA轉(zhuǎn)染786-0，采用細(xì)胞增值檢測(cè)、克隆形成檢測(cè)、遷移檢測(cè)、侵襲檢測(cè)、流式細(xì)胞檢測(cè)，觀察下調(diào)mTOR對(duì)腎癌細(xì)胞功能及細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果：生物信息搜索提示mTOR是miR-99a的靶基因，mTOR在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于HK-2，腎癌細(xì)胞及動(dòng)物模型中上

9、調(diào)miR-99a后mTOR表達(dá)明顯下調(diào)，熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)mTOR是miR-99a的靶基因。miR-99a模擬物轉(zhuǎn)染786-0后mTOR信號(hào)通路相關(guān)因子及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白均表達(dá)下調(diào)，mTOR-siRNA轉(zhuǎn)染786-0可抑制腎癌細(xì)胞增殖、存活，并阻滯細(xì)胞周期G1期，而細(xì)胞遷移及侵襲不受抑制。
　　結(jié)論： mTOR是miR-99a的靶基因，miR-99a可直接通過(guò)mTOR信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期的阻滯，下調(diào)mTOR可部分?jǐn)M表型腎