MGMT基因表達在腎細胞癌治療中的作用研究.pdf

1、腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)在所有腎細胞癌占75％-80％，是最常見的病理類型。化療仍是目前臨床上常用的方法，但治療效果常因腫瘤本身具有耐藥或治療后出現(xiàn)耐藥性而失敗。目前為止，耐藥機制主要有P-糖蛋白的過表達、DNA拓撲異構(gòu)酶的低表達、抗凋亡基因bcl-2的過表達以及DNA修復(fù)蛋白的過表達等。
　　烷化劑是一大類重要的臨床抗腫瘤藥物，主要造成DNA堿基的烷基化損傷，其中

2、以形成O6-甲基鳥嘌呤對細胞的威脅最大，造成細胞突變與死亡。O6-甲基鳥嘌呤可以由O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)修復(fù)。MGMT對烷化劑損傷的修復(fù)使其在腫瘤化療中發(fā)揮雙重作用。一方面保護正常組織免于烷化劑的損傷和二次癌癥的發(fā)生，另一方面引起腫瘤組織對烷化劑類化療藥物的耐藥性。
　　MGMT的表達在正常組織中要低于其腫瘤組織，而且不同腫瘤組織中呈現(xiàn)出不一樣的模式。然而，在腎透明細胞癌中MGMT基因的表達目前仍不清楚。甲

3、基化抑制劑5-Aza-CdR能夠逆轉(zhuǎn)DNA的異常甲基化、重新激活失活的抑癌基因的表達，因此其具有作為抗腫瘤藥物的潛力。
　　本課題擬從基因和蛋白水平研究MGMT基因在腎透明細胞癌中的表達，并闡明MGMT在耐藥腎透明細胞癌治療中的作用。同時我們將5-Aza-CdR與絲裂霉素聯(lián)合作用于腎癌細胞，探討應(yīng)用5-Aza-CdR能否提高腎癌細胞對絲裂霉素的敏感性。
　　第一部分 MGMT基因表達對腎細胞癌的耐藥性影響的研究
　　一

4、、MGMT在腎透明細胞癌組織和細胞中表達上調(diào)
　　1、采用免疫組化的方法對60個組織標本中的MGMT表達情況進行了檢測。免疫組化染色著色結(jié)果可以將60例病例分為MGMT不表達(-)，低表達(+)和高表達(++，+++)三組，其中高表達的組占62％(37/60)。實時定量PCR結(jié)果顯示，與正常組織相比，腫瘤組織中MGMT mRNA水平表達上調(diào)2倍以上的占85％(17/20)
　　2、選取兩株癌細胞ACHN和786-0以及正常腎

5、細胞株HK-2為研究對象。結(jié)果表明兩株癌細胞中MGMT mRNA水平遠高于正常細胞。Western blot結(jié)果進一步驗證了MGMT在腫瘤細胞中高表達。
　　二、MGMT表達與腎透明細胞癌的階段有關(guān)
　　進一步分析了MGMT水平與癌癥進程之間的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)MGMT表達水平與腫瘤病理級別和臨床階段有著正相關(guān)。在G1，G2和G3/G4期的腎透明細胞癌中MGMT高表達的比例分別占40.0％，67.7％和77.3％(p=0.04)

6、。在T1，T2和T3/T4階段中MGMT高表達比例分別為39.1％，70.1％和80.0％(p=0.02)。
　　三、下調(diào)MGMT表達可以增強ACHN和786-0細胞對烷化劑BCNU或TMZ的敏感性。
　　1、首先通過western blot檢測siRNA的作用，干擾siRNA作用48h后MGMT蛋白表達明顯下降。
　　2、MTT結(jié)果顯示，下調(diào)MGMT表達可以使ACHN細胞對烷化劑BCNU和TMZ更加敏感，
　　

7、3、以腫瘤細胞株786-0為對象進行實驗。下調(diào)MGMT同樣顯著增加786-0細胞對烷化劑BCNU和TMZ的敏感性。
　　第二部分 5-Aza-CdR對腎癌細胞株CAKI-1及786-0的化療敏感性的影響一、 MTT法檢測絲裂霉素對CAKI-1細胞抑制作用
　　我們用MTT法分別檢測不同濃度絲裂霉素作用于CAKI-1細胞24 h的生長抑制率，發(fā)現(xiàn)絲裂霉素能抑制細胞的增值，并呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　二、初步結(jié)果顯示甲基化抑制

8、劑5-Aza-CdR能夠增強腎癌細胞786-0對絲裂霉素的敏感性
　　MTT檢測發(fā)現(xiàn)單用5-Aza-CdR對人腎癌細胞株786-0增值呈現(xiàn)明顯的抑制作用。不同濃度的5-Aza-CdR聯(lián)合絲裂霉素對腫瘤細胞的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著5-Aza-CdR濃度的增加，腫瘤細胞的抑制率明顯升高。
　　第三部分 結(jié)論及創(chuàng)新點
　　一、結(jié)論
　　1、研究證實了MGMT在腎透明細胞癌組織和細胞中的表達呈高表達;
　　2

9、、研究分析發(fā)現(xiàn)MGMT的表達水平與腎透明細胞癌的惡性程度呈正相關(guān);
　　3、MGMT參與腎透明細胞癌對烷化劑類化療藥物的耐藥過程;
　　4、甲基化抑制劑5-Aza-CdR能夠增強腎癌細胞786-0對絲裂霉素的敏感性。
　　二、創(chuàng)新點與不足之處
　　1、本研究首次證實了MGMT在腎透明細胞癌組織和細胞中表達高表達，并且發(fā)現(xiàn)MGMT的表達水平與腎透明細胞癌的惡性程度呈正相關(guān)。本研究首次發(fā)現(xiàn)下調(diào)MGMT表達可以增強AC