MicroRNA-184在腎細(xì)胞癌中低表達(dá)的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)原發(fā)于腎小管上皮(renal tubule epidermis)，是成人泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在泌尿系統(tǒng)中僅次于膀胱癌，腎細(xì)胞癌的生物學(xué)行為及其特征較為復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚未完全明確，約有1/3的患者初次就診時(shí)已有不同程度的擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移，約1/3的局限性腎癌患者手術(shù)切除腫瘤后仍會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，腎癌傳統(tǒng)放化療的效果均不理想，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的5年生存率小于10

2、％，2年生存率小于20％。因此，探索腎癌的發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制，尋找有效的診斷、預(yù)后分子標(biāo)志物及分子治療靶點(diǎn)，具有重要的意義。microRNAs是一類廣泛存在動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性非編碼基因，大小約21～25個(gè)堿基，對(duì)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)有重要的調(diào)控作用，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。當(dāng)前研究顯示microRNAs對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展及凋亡、侵襲等生物學(xué)行為具有調(diào)控作用，隨著對(duì)microRNAs的研究進(jìn)一步深入，microRNAs有望成為腫瘤診斷、治

3、療及判斷預(yù)后的靶點(diǎn)及分子標(biāo)志物。leng等研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-184在腎癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁正常腎組織，提示microRNA-184在腎癌中可能受到抑制，但未對(duì)其機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。而在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，已有研究發(fā)現(xiàn)microRNA-184具有抑癌基因的作用。通過靶基因預(yù)測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)microRNA-184的靶基因?yàn)榈鞍准っ?(AKT2)，F(xiàn)oley等研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，microRNA-184可以抑制AKT2，影響腫

4、瘤的發(fā)生發(fā)展。在此基礎(chǔ)上，本研究旨在探索microRNA-184對(duì)腎癌的作用及其分子機(jī)制。
　　本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述。
　　第一部分 microRNA-184及AKT2在腎癌中的表達(dá)
　　目的：1 研究腎癌組織中的microRNA-184的表達(dá)水平。2 研究AKT2在腎癌組織中的表達(dá)水平。
　　方法：1 應(yīng)用realtime-PCR的方法，檢測(cè)腎癌組織與其相應(yīng)癌旁組織中microRNA-184的表達(dá)水平

5、。2 應(yīng)用realtime-PCR的方法，檢測(cè)腎癌組織與其相應(yīng)癌旁組織中AKT1、AKT2的表達(dá)水平。3 運(yùn)用SPSS18.0軟件，采用x2檢驗(yàn)分析microRNA-184與AKT2在腎癌組織中表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　結(jié)果：1、腎癌組織中microRNA-184的表達(dá)顯著低于癌旁組織Real time-PCR的結(jié)果顯示:在新鮮的腎癌組織中，microRNA-184呈低表達(dá)水平，在相互配對(duì)的6對(duì)新鮮腎癌組織與癌旁組織中，microR

6、NA-184的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織。2、腎癌組織中AKT2的表達(dá)顯著高于癌旁組織，AKT1的表達(dá)與癌旁組織中無明顯區(qū)別。Real time-PCR的結(jié)果顯示:在新鮮的腎癌組織中，AKT2的表達(dá)明顯高于配對(duì)的癌旁組織，而AKT1的表達(dá)在新鮮癌組織與癌旁組織中無明顯區(qū)別。3、在腎癌組織中，microRNA-184的表達(dá)水平高低與AKT2的表達(dá)水平高低具有相關(guān)性以x2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析12例新鮮腎癌標(biāo)本的microRNA-184和AKT2的表達(dá)

7、水平，發(fā)現(xiàn)其具有相關(guān)性，概率P＜0.05。
　　結(jié)論:MicroRNA-184在腎癌中低表達(dá),AKT2在腎癌中高表達(dá)
　　第二部分 microRNA-184對(duì)腎癌細(xì)胞中AKT2表達(dá)的作用。
　　目的：研究高表達(dá)microRNA-184對(duì)腎癌細(xì)胞中AKT2表達(dá)水平的影響，探討microRNA-184作用于腎癌細(xì)胞的分子機(jī)制。
　　方法1 采用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)microRNA-184的腎癌細(xì)胞株。

8、2 采用realtime-PCR和免疫印跡法對(duì)高表達(dá)microRNA-184后腎癌細(xì)胞中AKT1、AKT2、p-AKT1、p-AKT2、PI3K的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，分析microRNA-184對(duì)腎癌細(xì)胞中AKT2的作用。
　　結(jié)果：1 上調(diào)microRNA-184可抑制AKT2的表達(dá)在穩(wěn)定高表達(dá)microRNA-184的實(shí)驗(yàn)組中，AKT2的表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)染無意義片段的陰性對(duì)照組和單純腎癌細(xì)胞的空白對(duì)照組。2 上調(diào)microRNA-

9、184可抑制AKT2的活化在穩(wěn)定高表達(dá)microRNA-184的實(shí)驗(yàn)組中，p-AKT2的表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)染無意義片段的陰性對(duì)照組和單純腎癌細(xì)胞的空白對(duì)照組，提示AKT2的活化受到抑制。
　　結(jié)論：1 microRNA-184可抑制AKT2的表達(dá)和活化。2 microRNA-184通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，來影響腎癌的發(fā)生發(fā)展。
　　第三部分 microRNA-184對(duì)腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　目的：研究高表

10、達(dá)microRNA-184對(duì)腎癌細(xì)胞增殖能力的影響。研究高表達(dá)microRNA-184對(duì)腎癌細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　方法：1 應(yīng)用流式細(xì)胞儀法檢測(cè)高表達(dá)microRNA-184后，腎癌細(xì)胞的凋亡情況。2 應(yīng)用MTT法檢測(cè)高表達(dá)microRNA-184后，腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。3 應(yīng)用Transwell法檢測(cè)高表達(dá)microRNA-184后對(duì)腎癌細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：1 高表達(dá)microRNA-184可增加腎癌細(xì)胞的

11、凋亡。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的右下象限細(xì)胞群和右上象限細(xì)胞群細(xì)胞總數(shù)明顯多于空白組和陰性對(duì)照組;陰性對(duì)照組和空白組腎癌細(xì)胞的凋亡情況無明顯差別，說明在高表達(dá)microRNA-184后，腎癌細(xì)胞的凋亡明顯增加，microRNA-184具有促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡的作用。2 高表達(dá)microRNA-184可抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，隨著培育時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組（高表達(dá)microRNA-184腎癌細(xì)胞）的細(xì)胞生長(zhǎng)

12、速度明顯低于空白組（腎癌細(xì)胞）和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染無意義片段的腎癌細(xì)胞）?？瞻捉M和陰性對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)情況無明顯區(qū)別。說明microRNA-184可以抑制腎癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)。3 高表達(dá)microRNA-184可抑制腎癌細(xì)胞的侵襲能力。Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)組（高表達(dá)microRNA-184腎癌細(xì)胞）中，侵襲入Transwell小室內(nèi)的腎癌細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯少于空白組（腎癌細(xì)胞）和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染無意義片段腎癌細(xì)胞），說明在高表達(dá)