Amycolatopsis orientalisZEL-1的聚乙烯降解特性及其基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的降解關(guān)鍵基因和代謝通路研究.pdf

1、為解決聚乙烯塑料在環(huán)境中難降解的問(wèn)題，本研究篩選出一株菌用于聚乙烯塑料生物降解研究。經(jīng)篩選純化，對(duì)該菌進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)和16SrDNA序列分析;將菌株先后接種于以不同分子量聚乙烯(PE)粉末(Mw=2000、5000、100000)和膜片(Mw＞100000)為唯一碳源的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm培養(yǎng);每24小時(shí)，用分光光度法測(cè)定菌體生長(zhǎng)濃度和胞外蛋白含量;培養(yǎng)60天后，稱取殘留PE重量，用掃描電子顯微鏡觀察膜片表觀，用拉力

2、測(cè)試機(jī)、水接觸角測(cè)定儀以及紅外光譜儀測(cè)定膜片性能。
　　為進(jìn)一步提高原始菌株對(duì)高分子量PE的降解能力，本研究對(duì)原始菌株進(jìn)行了誘變處理。采用紫外輻照、微波熱效應(yīng)、LiCl、鹽酸羥胺、吖啶橙以及紫外+吖啶的方法對(duì)菌株進(jìn)行誘變;用分子量2000、5000、100000再到膜片的PE分子量梯度篩選法，對(duì)誘變菌株進(jìn)行篩選;通過(guò)誘變菌株在以聚乙烯為唯一碳源的培養(yǎng)基中的菌體生長(zhǎng)情況、胞外蛋白含量、以及膜片失重率等指標(biāo)，選出降解性能最優(yōu)的菌株，再

3、將該菌株與原始菌株在相同培養(yǎng)條件下（以PE膜片為唯一碳源）培養(yǎng)60天，測(cè)定膜片力學(xué)性能。
　　為找出降解PE的關(guān)鍵基因和代謝通路，我們將原始菌株在不同碳源培養(yǎng)條件下的（G組:以可溶性淀粉為唯一碳源;W組:以PE為唯一碳源）基因表達(dá)情況進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，經(jīng)RNA提取純化、建庫(kù)、測(cè)序、質(zhì)控等過(guò)程，再進(jìn)行GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋比對(duì)、聚類和富集分析;對(duì)兩個(gè)處理組的基因表達(dá)量進(jìn)行差異比較;最后隨機(jī)選取差異基因進(jìn)行RT-PCR表達(dá)

4、量驗(yàn)證。
　　結(jié)果表明，篩選出的菌株為放線菌屬的東方擬無(wú)枝酸菌（Amycolatopsis orientalis），命名為ZEL-1。該菌在分子量越低的聚乙烯培養(yǎng)液中，菌濃度、胞外蛋白含量、還原糖含量、聚乙烯失重率越高，菌液pH值下降得越快;電鏡觀察發(fā)現(xiàn)膜片表面有大量降解孔洞;膜片拉伸強(qiáng)度降低74.15％，斷裂伸長(zhǎng)率減少84.90％，力學(xué)性能顯著下降;水接觸角從78.58±0.10°變小到41.25±0.16°，親水性增大;紅外光

5、譜研究結(jié)果表明，膜片在菌株的降解作用下先后生成酮羰基和酯羰基。
　　誘變育種結(jié)果表明，紫外輻照50s，微波誘變800Hz、120s，0.02％吖啶橙，0.7％LiCl，0.6％鹽酸羥胺，為各方法的最優(yōu)的誘變劑量。復(fù)合誘變采用紫外50s的突變菌株為出發(fā)菌株，再用0.02％吖啶橙誘變。PE培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)趨勢(shì)，除鹽酸羥胺組外，其他組均優(yōu)于原始菌株組;紫外組胞外蛋白含量較原始組平均提高2.06倍，微波組平均提高1.24倍，吖啶組平均提高

6、2.70倍，鹽酸羥胺組平均提高1.60倍，復(fù)合誘變組平均提高3.30倍;鹽酸羥胺組膜片失重率低于原始菌株組，其他組均高于原始菌株組，復(fù)合誘變組膜片失重率最大，高于原始組2.28倍;選擇復(fù)合誘變組菌株UV-AO-1為優(yōu)勢(shì)菌株，PE降解60天后，UV-AO-1組水接觸角比原始菌株組減小2.5°;拉伸強(qiáng)度減小3.37Mpa，斷裂伸長(zhǎng)率減少39.62％。
　　轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，此次共得到12372(63.24％)個(gè)非冗余Unigene，

7、其中2095條Unigene富集于代謝過(guò)程組中;與COG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有3328條Unigene與COG數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因具有同源性;涉及到代謝活動(dòng)相關(guān)的Unigene占50.57％;發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因423個(gè)，與G組相比，W組有293個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，130個(gè)基因下調(diào);AlkB基因差異表達(dá)最為顯著。與KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有5776條轉(zhuǎn)錄本比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，有92個(gè)代謝通路出現(xiàn)差異;碳代謝、氨基酸合成、丙酮酸代謝途徑的差異基

8、因表達(dá)上調(diào)數(shù)量較多，乙酰-CoA合成、脂肪酸代謝的相關(guān)基因表達(dá)差異上調(diào)顯著，檸檬酸循環(huán)的差異基因下調(diào)明顯。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果表明，熒光定量PCR得出的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的差異基因表達(dá)量上下調(diào)模式基本一致，證明此次轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果可信。
　　綜上所述，本研究菌株ZEL-1能夠直接降解普通的低、中、高分子量的PE塑料;誘變菌株UV-AO-1的降解性能優(yōu)于原始菌株，具有更大的應(yīng)用潛力。原始菌株在PE碳源的培養(yǎng)條件下