甘草酸二銨對百草枯誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞GR及TLR4的影響.pdf

1、目的:百草枯(PQ)中毒是臨床上常見的急危重癥，致死率高，并且目前尚無特效拮抗劑。肺是PQ主要損傷的靶器官，尤其肺泡上皮細(xì)胞是其特異性靶點。課題組前期的體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，甘草酸二銨(DG)可促進急性肺損傷大鼠中糖皮質(zhì)激素受體(GR)的表達，并且可抑制PQ中毒大鼠中TLR4-MyD88-NF-k B通路的過度表達，進而改善大鼠預(yù)后。本實驗以PQ誘導(dǎo)肺泡上皮Ⅱ型細(xì)胞(AECⅡ)建立體外模型，旨在研究GR、高遷移率族蛋白1(HMGB1)、Toll

2、樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子88(MyD88)、核因子kB p65(NF-kB p65)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、生長轉(zhuǎn)化因子β1(TGF-β1)相關(guān)信號分子在PQ中毒條件下的表達變化及DG預(yù)治療對這些信號通路分子的影響及作用機制。
　　方法:大鼠肺泡上皮Ⅱ型細(xì)胞分為6組:空白對照組(NS組)、PQ中毒組(PQ組)、DG預(yù)治療組（DG組）、PQ中毒受體阻斷組(PR組)、DG預(yù)治療受體阻斷組(PDR組)、無水乙醇對照組（

3、NE組）。NS組:不加任何藥物干預(yù)，培養(yǎng)細(xì)胞24h; PQ組:以含1000μmol/LPQ的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24h; DG組:先以含0.6 mg/mL DG的培養(yǎng)基培養(yǎng)2h，再以含0.6 mg/mL DG+1000μmol/L PQ的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24h; PR組:先以含100nMRU486的培養(yǎng)基培養(yǎng)2h，再以含100nMRU486+1000μmol/L PQ的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24h; PDR組:先以含100nMRU486的培養(yǎng)基培養(yǎng)2h

4、，再以含100nM RU486+0.6mg/mL DG的培養(yǎng)基培2h，最后以含100 nM RU486+0.6mg/mL DG+1000μmol/L PQ的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24h; NE組:以含0.33μ/mL無水乙醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24h。以MTT檢測不同濃度的PQ和DG對肺泡上皮細(xì)胞增殖的影響。倒置顯微鏡下觀察每組細(xì)胞的形態(tài)、生長狀況。RT-PCR方法檢測GR、HMGB1、TLR4、MyD88、NF-kB p65和TGF-β1的基因表

5、達。ELISA方法檢測GR、HMGB1、TLR4、MyD88、NF-kBp65、TGF-β1和TNF-α的蛋白質(zhì)量濃度。
　　結(jié)果:①MTT試驗中，細(xì)胞的存活率隨著PQ濃度的增加而降低，在濃度為200μmol/L，400μmol/L，600μmol/L，800μmol/L，1000μmol/L和2000μmol/L的PQ培養(yǎng)基對應(yīng)的細(xì)胞存活率分別為(88.12±3.15)％，（81.39±3.31)％,(70.90±3.40)％,

6、(59.80±3.15)％,(48.31±3.58)％，（31.56±3.74)％，（16.46±3.16)％,IC50的PQ濃度為920.87μmol/L。②在DG預(yù)治療的情況下，PQ誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的生存率升高，含0mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、lmg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL濃度DG的培養(yǎng)基對應(yīng)的細(xì)胞生存率分別為（47.83±0.54）％，(51.99±1.37)

7、％，（59.32±2.34）％，(66.40±3.26)％,(64.89±3.37)％,(60.78±2.24)％,(55.09±2.42)％,（48.72±0.40）％。③倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與NS組比較，PQ組、PR組、DG組和PDR組中細(xì)胞膜出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞貼壁不良，可見細(xì)胞脫落凋亡，甚至出現(xiàn)細(xì)胞碎片。而DG組和PDR組中細(xì)胞損傷較PQ和PR組相比明顯減輕。④與NS組比較，PQ組和DG組中GR的水平明顯降低（均，P

8、＜0.01），但HMGB1、TLR4、MyD88、NF-k B p65、TNF-α、TGF-β1的水平均有不同程度的升高（均，P＜0.01）。并且DG組中GR表達降低的程度小于PQ組(P＜0.01)，而DG組中HMGB1、TLR4、MyD88、NF-kB p65、TNF-α、TGF-β1表達升高的程度均小于PQ組（均，P＜0.01）。⑤加入阻滯劑RU468后，DG組與PDR組相比，PQ組與PR組相比，NS組和NE組相比，其中HMGB1、