HIF-1αsiRNA對(duì)缺氧誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、新生兒急性肺損傷是新生兒時(shí)期常見疾病和主要致死原因之一，國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為缺氧肺損傷的發(fā)病機(jī)理主要是：缺氧缺血直接導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞水腫、壞死；氧自由基損傷；細(xì)胞因子損傷等。近年來有研究認(rèn)為肺泡上皮細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)異?？赡苁切律鷥悍螕p傷的重要發(fā)病機(jī)制之一。HIF-1α是細(xì)胞對(duì)缺氧適應(yīng)反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子，它在許多細(xì)胞事件中起作用，目前認(rèn)為HIF-1α在缺氧肺泡上皮細(xì)胞凋亡中意義重大。研究缺氧肺損傷AEC凋亡的相關(guān)機(jī)制及減少其

2、凋亡是防治新生兒肺損傷的一個(gè)新策略。 目的: 1．觀察缺氧誘導(dǎo)大鼠肺泡上皮細(xì)胞株(CCL149,L<,2>型)的凋亡變化，研究凋亡在缺氧肺泡上皮細(xì)胞損傷中的作用； 2．初步探討HIF-1α在缺氧誘導(dǎo)CCL149凋亡中的意義，為進(jìn)一步研究新生兒缺氧肺損傷的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)； 3．應(yīng)用HIF-1αsiRNA對(duì)CCL149進(jìn)行體外干預(yù)并評(píng)估干擾效果，為防治新生兒肺損傷提供一個(gè)新策略及方向。 方法:

3、 1．以CCL149為研究對(duì)象，選擇5種不同濃度氯化鈷 (Cobalt chloride,CoCl<,2>)作用CCL149，采用MTT法檢測(cè)各濃度4個(gè)時(shí)點(diǎn)(4、12、24、48小時(shí))細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，根據(jù)半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)篩選出COCl<,2>合適劑量建立細(xì)胞體外缺氧模型。 2．利用脂質(zhì)體將構(gòu)建好的HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染至CCL149，通過熒光顯微鏡觀察熒光HIF-1α siRNA對(duì)缺氧誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡

4、影響的實(shí)驗(yàn)研究及RT-PCR方法檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效果，檢驗(yàn)HIF-1αtsiRNA在CCL149的有效性。 3．實(shí)驗(yàn)分為兩大組：對(duì)照組，包括正常組和單純?nèi)毖踅M(分別缺氧4、24、48小時(shí)組)：HIF-1α siRNA干預(yù)組，包括轉(zhuǎn)染后分別缺氧4、24、48小時(shí)組。采用Hoechst33342染色熒光顯微鏡、Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組凋亡變化，采用透射電子顯微鏡觀察缺氧時(shí)CCL149凋亡典型形態(tài)學(xué)變化。 4．

5、采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blot檢測(cè)各組HIF-1α mRNA、蛋白水平變化，結(jié)合各組凋亡率，評(píng)價(jià)HIF-1αsiRNA抑制缺氧誘導(dǎo)CCL149凋亡的效應(yīng)。 結(jié)果: 1．不同濃度COCl<,2>對(duì)CCL149的生長(zhǎng)抑制率：MTT結(jié)果顯示，相同作用時(shí)間下，隨著CoCl<,2>濃度增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率增加；相同作用濃度下，隨著CoCl<,2>作用時(shí)間增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率增加；通過描繪生長(zhǎng)抑制曲線，我們得出作用

6、CCL149 24h半數(shù)抑制濃度為467 μmol/L，在后續(xù)的研究中選擇500 μmol/L濃度COCl<,2>作用細(xì)胞建立體外細(xì)胞缺氧模型。 2．HIF-1αsiRNA能有效沉默缺氧引起CCL149中HIF-1αmRNA表達(dá)：PEGFP-luc轉(zhuǎn)染CCL149 48h后熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率50％以上；RT-PCR結(jié)果顯示：正常組HIF-1αmRNA相對(duì)含量為0.906±0.076，缺氧24h組HIF-1αmR

7、NA相對(duì)含量為1．576__+0．048，與正常組比較有顯著性差異(P<0．01)，轉(zhuǎn)染后缺氧24h組HIF-1αmRNA相對(duì)含量為0.674±0.035，較缺氧24h組下調(diào)57％(P<0.01)。 3．COCl<,2>模擬缺氧可誘導(dǎo)CCL149凋亡：透射電鏡檢測(cè)出CCL149凋亡典型形態(tài)學(xué)變化，缺氧24h細(xì)胞出現(xiàn)體積變小，染色質(zhì)致密固縮聚集于胞核，核質(zhì)沿核膜內(nèi)側(cè)排列等現(xiàn)象；熒光顯微鏡觀察，缺氧4h出現(xiàn)散在凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞核可

8、見濃染致密的顆粒塊狀熒光，染色不均勻，正常組、單純?nèi)毖?h、24h、48h組凋亡率(％)分別為：1.50±0.50、5.83±0.76、15.00±3.28、51.50±3.00，隨缺氧時(shí)間增加CCL149凋亡率增加(P<0.05)；流式細(xì)胞儀分析顯示，正常組、單純?nèi)毖?h、24h、48h組早期凋亡率(％)分別為：0.379±0.113、4.317±0.055、18.506±2.274、12.768±2.245，單純?nèi)毖踅M與正常組比較凋

9、亡率有增加(P<0.01)，缺氧48小時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)壞死現(xiàn)象。 4．HIF-1α對(duì)缺氧CCL149細(xì)胞凋亡的調(diào)控：正常組HIF-1α蛋白相對(duì)含量為0.21±HIF-1α siRNh對(duì)缺氧誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究0.026，單純?nèi)毖?h、24h、48h組HIF-1α蛋白相對(duì)含量分別為0.69±0.035、1.02±0.044、0.71±0.046，較正常組明顯增強(qiáng)(P<0.01)。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，單純?nèi)毖踅MHIF-

10、1α蛋白表達(dá)與其凋亡率變化呈正相關(guān)(R=0.707，P=0.01)。 5. HIF-1α siRNA對(duì)缺氧CCL149細(xì)胞凋亡的影響：HIF-1α siRNA干預(yù)后缺氧4h、24h、48h組HIF-1α mRNA相對(duì)含量分別為：0.32±0.03、0.39±0.23、0.40±0.10，與單純?nèi)毖醺鹘M比較HIF-1α mRNA分別下調(diào)72％、70％、67％(P值均<0.01)；干預(yù)后缺氧4h、24h、48h組HIF-1α蛋白相對(duì)

11、含量分別為：0.25±0.046、0.23±0.072、0.28±0.079，與單純?nèi)毖醺鹘M比較HIF-1α蛋白分別下調(diào)64％、77％、60％(P值均<0.01)。與此同時(shí)，熒光顯微鏡檢測(cè)HIF-1α siRNA干預(yù)4h、24h、48h組凋亡率(％)分別為2.17±0.76、8.17±0.76、14.33±1.04，與單純?nèi)毖醺鹘M凋亡率比較明顯降低(P值均<0.01)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)HIF-1α siRNA干預(yù)4h、24h、48h組早期

12、凋亡率(％)分別為3.559±0.186、1.279±0.489、0.924±0.151，與單純?nèi)毖醺鹘M凋亡率比較明顯降低(P值均<0.01)。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，HIF-1αmRNA與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(R=0.749，P<0.001)HIF-1α蛋白水平與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(熒光顯微鏡檢測(cè)法，R=0.894，P=0.001；流式細(xì)胞儀檢測(cè)法，R=0.781，P=0.013)。 結(jié)論: 1.通過在培養(yǎng)液加入COC

13、l<,2>建立了體外AEC缺氧模型，前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建好的HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染至AEC并能夠有效的下調(diào)其HIF-1αmRNA表達(dá)，是沉默AEC中HIF-1α的有效工具。 2.缺氧可以誘導(dǎo)AEC凋亡，隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率增加，提示了AEC凋亡參與了缺氧肺損傷的發(fā)病機(jī)制。 3.缺氧誘導(dǎo)凋亡時(shí)HIF-1α蛋白表達(dá)增加，同時(shí)HIF-1α siRNA可以通過降低HIF-1αmRNA、蛋白表達(dá)而減少缺氧誘導(dǎo)的AEC凋亡，提示