18F-FDG PET-CT代謝體積參數(shù)及microRNA-150為基礎(chǔ)信號(hào)調(diào)節(jié)通路對(duì)非小細(xì)胞肺癌預(yù)后研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 基線18F-FDG PET/CT不同閾值的代謝體積參數(shù)作為Ⅲ期非小細(xì)胞肺癌預(yù)后因素的研究
　　目的:18氟脫氧葡萄糖正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)體層掃描(18fluorodeoxy-glucose positron emission tomography，18F-FDG PET)對(duì)NSCLC有非常重要的預(yù)后價(jià)值，其中腫瘤代謝體積(metabolic tumor volume，MTV)和病灶總

2、糖酵解值(total lesion glycolysis，TLG)在NSCLC的預(yù)后研究中仍存在爭(zhēng)議。
　　細(xì)化并精確分析高代謝體積對(duì)Ⅲ期不能手術(shù)的NSCLC上的預(yù)后價(jià)值。而且，應(yīng)用治療前基線參數(shù)進(jìn)行預(yù)后評(píng)估對(duì)于提高生存率是更加有益的，原因在于這樣做可以使腫瘤患者根據(jù)不同的預(yù)后進(jìn)行個(gè)體化分層治療，使用最適合的治療方案。
　　方法:本研究共收集78例NSCLC病例，均收治于山東省腫瘤醫(yī)院放療科，這些患者的住院時(shí)間范圍在2009

3、年1月1日至2012年12月31日。所有的病例在同步放化治療前進(jìn)行18F-FDG PET/CT顯像全身檢查，并需要完善如下相關(guān)檢查:支氣管鏡檢查或CT引導(dǎo)下經(jīng)胸穿刺活檢、頭部CT或MR檢查、胸部及腹部增強(qiáng)CT，以明確TNM分期。詳細(xì)記錄了每個(gè)病例的相關(guān)臨床特征參數(shù)，如性別，年齡，腫瘤位置，T分期，N分期，AJCC分期，病理類型，ECOG評(píng)分，表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)突

4、變情況等以及PET/CT圖像的代謝參數(shù)，包括原發(fā)灶的最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUVmax)，平均標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUVmean)，MTV，TLG。MTV是指大于或等于一個(gè)具體的SUV閾值的腫瘤代謝體積。COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型(Cox's proportional hazards regression model)用于進(jìn)行單因素分析和多因素分析，這些變量包括PET/CT相關(guān)參數(shù)，如SUVmax，TLG50％，TLG60％，MTV25，MTV40％，MTV

5、50％，MTV60％，MTV70％，MTV80％，MTV90％，CTV及AUC-CSH等，和臨床變量，如性別，年齡，腫瘤位置，AJCC分期，T分期，N分期，ECOG評(píng)分和病理類型。臨床變量為二分類或三分類變量;PET/CT測(cè)得參數(shù)包括SUVmax，AUC-CSH,CTV,MTV25,MTV40％,MTV50％,MTV60％,MTV70％,MTV80％,MTV90％,TLG50％，TLG60％，通過(guò)各變量的中位數(shù)將患者分為兩個(gè)亞組，即以上

6、各變量均為二分類變量。每個(gè)臨床變量亞組間的差異通過(guò)log-rank檢驗(yàn)完成。治療完成以后，所有的患者均開(kāi)始每三個(gè)月一次的隨訪。
　　結(jié)果:COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型單因素分析中，MTV50％，MTV60％，MTV70％，TLG50％，TLG60％，性別與ECOG與OS顯著相關(guān)(HR=0.489，P(MTV50％)=0.013;HR=0.414,P(MTV60％)=0.002;HR=0.534,P(MTV70％)=0.024;HR=0.51

7、3,P(TLG50％)=0.013;HR=0.549,P(TLG60％)=0.029;HR=0.454,P(sex)=0.008;HR=0.500,P(ECOG)=0.011)，而MTV50％,MTV60％,MTV70％,TLG50％,TLG60％和ECOG與PFS顯著相關(guān)(HR=0.477，P(MTV50％)=0.004;HR=0.500，P(MTV60％)=0.007;HR=0.554，P(MTV70％)=0.020;HR=0.50

8、2,P(TLG50％)=0.006;HR=0.596,P(TLG60％)=0.038;HR=0.496,P(ECOG)=0.005)。在COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析中，TLG50％與OS顯著相關(guān)（HR=0.423，P=0.023），與PFS顯著相關(guān)(HR=0.457，P(TLG50％)=0.029)。MTV60％與PFS顯著相關(guān)(HR=0.402，P(MTV60％)=0.042)。SUVmax對(duì)于非手術(shù)Ⅲ期非小細(xì)胞肺癌OS與PFS都不是

9、獨(dú)立的預(yù)后因素（HR=0.885，P=0.717;HR=0.928，P=0.809）。為避免多重共線性，這些PET/CT代謝參數(shù)都是分別進(jìn)入模型分析，并且使用年齡、性別、分期、病理類型、ECOG評(píng)分和腫瘤位置進(jìn)行校正。
　　結(jié)論:
　　1.同步放化療的Ⅲ期NSCLC中，基線PET代謝體積參數(shù)有一定的預(yù)后價(jià)值。
　　2.不同的SUV閾值來(lái)界定MTV而進(jìn)行預(yù)后分析是很重要且必要的。
　　3.MTV60％與PFS統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、上有顯著地相關(guān)性，MTV60％數(shù)值越大，PFS越短。
　　4.TLG50％與OS和PFS在統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈負(fù)相關(guān)。TLG50％越大，OS與PFS均越短。
　　第二部分 抑制miR-150通過(guò)恢復(fù)APC表達(dá)抑制NSCLC的增殖和轉(zhuǎn)移
　　目的:探究了miR-150在NSCLC生物學(xué)侵襲行為方面的作用，還有miR-150與NSCLC的病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，并且，miR-150在NSCLC中的靶基因APC是通過(guò)生物信息學(xué)方

11、法預(yù)測(cè)的，并將在功能喪失或獲得實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。
　　方法:在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)收集了87例NSCLC組織，使用正常肺細(xì)胞系（BEAS2B細(xì)胞）和6個(gè)肺癌細(xì)胞株(95C，95D, H460，H358，SPCA1，H1299)。首先在六孔板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，然后使用miR-150抑制物/陰性對(duì)照抑制物，miR-150 mimics/miR-NC，和/或APC siRNA/siRNA NC，在指定時(shí)間轉(zhuǎn)染后獲取細(xì)胞。定量PCR在ABI 790

12、0 Fast Real-Time PCR system上操作，以U6為miR-150表達(dá)的內(nèi)參，3-磷酸甘油醛脫氫酶作為APC的對(duì)照。靶蛋白表達(dá)使用第一抗體檢測(cè)，β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)作為內(nèi)參。H1299細(xì)胞使用miR-150 inhibitor或inhibitor NC轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)72小時(shí)。隨后，細(xì)胞以胰蛋白酶消化。48小時(shí)后，以一抗和二抗檢測(cè)蓋玻片上的細(xì)胞，細(xì)胞核使用苯基吲哚(DAPI)染色。劃痕實(shí)驗(yàn)將使用miR-150 inhibitor

13、或inhibitorNC轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞。使用200ul無(wú)菌槍頭輕刮劃痕于單層細(xì)胞表面。劃痕的區(qū)域在開(kāi)始時(shí)和結(jié)束時(shí)同時(shí)進(jìn)行拍照，分析遷移的距離。細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)使用侵襲小室，被覆基質(zhì)膠的。將行結(jié)晶紫染色的H1299細(xì)胞，拍照和記錄圖像。MTT檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞孵育1h，測(cè)量各孔的吸光值在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處。克隆形成實(shí)驗(yàn)中，在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個(gè)孔接種400個(gè)轉(zhuǎn)染miR-150 inhibitor或inhibitor NC

14、的H1299細(xì)胞，培養(yǎng)15天，結(jié)晶紫染色并計(jì)數(shù)。使用流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)miR-150 inhibitor對(duì)細(xì)胞周期的作用。
　　結(jié)果:miR-150表達(dá)量與NSCLC病理分期顯著相關(guān)(x2=7.569;P=0.0227)。miR-150表達(dá)水平的變化與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯相關(guān)。與正常肺細(xì)胞系BEAS-2B對(duì)比，miR-150在6個(gè)肺癌細(xì)胞系(95C, 95D, H460，H358，SPCA1，H1299)的表達(dá)水平顯著增加。MT

15、T數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)染24，48，72小時(shí)后，轉(zhuǎn)染了miR-150 inhibitor的H1299細(xì)胞的增殖水平明顯下降(P＜0.05)。克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，這些沉默miR-150表達(dá)的細(xì)胞集落形成能力表現(xiàn)出受損的情況(P＜0.001)。FACS試驗(yàn)研究結(jié)果顯示miR-150表達(dá)抑制后，細(xì)胞在G1期顯著積聚，向S期和G2/M期轉(zhuǎn)化的細(xì)胞比例減少（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染miR-150 inhibitor的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染inhibitor NC的細(xì)胞比較

16、，在劃痕實(shí)驗(yàn)中劃痕愈合延遲(P＜0.01)，并且通過(guò)transwell assays基質(zhì)膠的侵襲能力下降（P＜0.01）。免疫染色顯示，與inhibitor NC組比較，在miR-150 inhibitor組細(xì)胞E-鈣粘蛋白（上皮細(xì)胞標(biāo)記）免疫熒光強(qiáng)度顯著增加，而波形蛋白（間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記）的免疫熒光減弱（P＜0.05）。此外，Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-150表達(dá)沉默上調(diào)了APC的表達(dá)，并且降低了下游信號(hào)分子β-連

17、環(huán)蛋白的積聚（P＜0.001），此二改變幾乎被siRNA引起的APC表達(dá)抑制所逆轉(zhuǎn)(P values＜0.001)。
　　結(jié)論:1.miR-150的表達(dá)水平在NSCLC腫瘤組織和NSCLC細(xì)胞系中都有上調(diào)。2.miR-150的水平與NSCLC的病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。3.沉默miR-150在NSCLC細(xì)胞系中，可以使NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)能力降低，細(xì)胞周期進(jìn)程受到阻滯，遷移和侵襲能力下降， EMT受到抑制。4.miR-150的靶