HSNGLPL多肽修飾聚氨酯的體內反應性研究.pdf

1、文章分為以下部分:
　　第一部分 分析HSNGLPL多肽修飾聚氨酯(HSNGLPL-PUs)的體外細胞相容性
　　目的:
　　通過分析材料浸提液對C2C12細胞增殖及毒性的影響，探討HSNGLPL-PUs的細胞相容性。
　　方法:
　　將合成的L-P-PU（50mg HSNGLPL修飾）、M-P-PU（100mg HSNGLPL修飾）及H-P-PU（150mg HSNGLPL修飾）按試樣表面積/浸泡液體積=

2、6cm2/mL比率提取浸提液(DMEM，48h)，并與C2C12細胞共培養(yǎng)48h，CCK-8檢測細胞增殖活性。
　　結果:
　　RGR細胞毒性評定表明，聚氨酯浸提液具有一定的細胞毒性（1級），但50-100mg濃度范圍內HSNGLPL多肽修飾并未改變聚氨酯的細胞活性。
　　結論:
　　HSNGLPL多肽成分的添加及處理過程不影響聚氨酯材料的細胞相容性。
　　第二部分 HSNGLPL-PUs材料的體內炎癥和免

3、疫反應性研究
　　目的:
　　分析植入肌內材料誘導的肌內炎性滲出及肌纖維的壞死和再生，明確HSNGLPL-PUs的體內反應性。
　　方法:
　　將HSNGLPL多肽液、BDO-PU（無HSNGLPL修飾）、L-P-PU、M-P-PU和H-P-PU材料(0.2×0.4cm2)植入腓腸肌內，在14d、28d、42d和56d，摘取小鼠腓腸肌，冰凍切片、H&E染色或免疫熒光染色并觀察:i）單核/巨噬細胞、T細胞、樹突狀細

4、胞(DCs)的滲出;ii）巨噬細胞凋亡;iii)植入物周邊肌纖維的壞死和再生、再生肌纖維MHC-Ⅰ表達。
　　結果:
　　14d，BDO-PU炎性滲出最顯著，隨后逐漸消退，56d時炎癥基本消失;L-P-PU、M-P-PU和H-P-PU誘發(fā)的炎性滲出在移植初期(7-14d)時低于BDO-PU，但炎癥持續(xù)時間長，56d仍可見滲出的淋巴細胞;在14d、28d和42d，BDO-PU肌內巨噬細胞凋亡數顯著高于L-P-PU、M-P-PU

5、和H-P-PU組，但56d時L-P-PU、M-P-PU和H-P-PU組仍可見較多的凋亡細胞;BDO-PU組肌內罕見DCs細胞(CD11c+)，但L-P-PU、M-P-PU和H-P-PU材料誘發(fā)更顯著的DCs滲出，滲出細胞的數量與PU材料內的HSNGLPL多肽濃度呈正相關;28d和42d時，各組材料周圍肌組織內都可見CD3+/CD4+T細胞，56d時，BDO-PU材料周圍CD4+T細胞基本消失，L-P-PU、M-P-PU和H-P-PU組仍

6、觀察到CD4+T細胞;各組植入材料周圍均可見肌纖維潰變，BDO-PU組于28d后可見新生肌纖維(Dystrophy+)，L-P-PU、M-P-PU和H-P-PU組則于植入早期(14d)出現(xiàn)肌纖維再生，HSNGLPL多肽濃度較高的H-P-PU組肌纖維的再生更為顯著，42d時該組材料周圍的損傷肌纖維基本完成修復，BDO-PU材料于56d時仍可見中央核肌纖維;各組PU材料均不能誘發(fā)再生肌纖維表達MHC-Ⅰ分子。
　　結論:
　　H

7、SNGLPL-PUs肌內植入后，將迅速誘發(fā)肌內炎癥反應及肌細胞壞死，滲出以單核-巨噬細胞為主。PU材料內HSNGLPL肽成分可能抑制炎癥細胞凋亡，從而導致炎癥的持續(xù)。此外，體內的植入材料逐漸降解并釋放HSNGLPL肽成分，可能有助于局部肌衛(wèi)星細胞的激活、增殖與分化，于移植后期促進肌纖維再生。
　　第三部分 分析體內、外條件下HSNGLPL-PUs對TGF-β的富集及釋放
　　目的:
　　明確合成的HSNGLPL-PUs

8、對TGF-β的富集及體內釋放。
　　方法:
　　將各組HSNGLPL-PUs浸泡于含有500pg/mL的重組人TGF-β緩沖液中4℃1h，Elisa檢測緩沖液中殘余的TGF-β濃度;肌內植入各組HSNGLPL-PUs材料，分別于14d和28d摘取肌組織，勻漿，Elisa檢測勻漿上清中TGF-β濃度。將預富集TGF-β的PU材料(HSNGLPL-PU-TGF-β)植入小鼠肌肉，分別于植入術后7，14，21，28d摘取肌肉，冰凍

9、切片，H&E及免疫熒光觀察炎癥滲出，masson染色觀察局部纖維化程度，或提取肌組織RNA，qRT-PCR觀察肌組織內質網應激相關分子水平改變。
　　結果:
　　體外條件下，HSNGLPL-PUs浸泡緩沖液中TGF-β水平顯著低于BDO-PU浸泡液，其降低程度與PU包含的HSNGLPL肽濃度呈正相關。14d時，包含H-P-PU材料的肌組織TGF-β濃度顯著高于HSNGLPL多肽注射組及BDO-PU組;28d時各組肌組織TGF

10、-β濃度無顯著差異。
　　較之BDO-PU和HSNGLPL-PU組，于移植7d和14d時，HSNGLPL-PU-TGF-β材料誘導更為劇烈的炎性滲出，但滲出范圍相對局限，持續(xù)時間較短，28d時炎癥基本消退。Masson染色可見，HSNGLPL-PU-TGF-β材料誘發(fā)的臨近肌組織纖維化（藍色）較其他材料組更加顯著。ER Stress標志分子(ATF6、Bip、Calnexin、Spliced XBP1、CHOP和Cathepsin

11、 D)mRNA表達水平可見，材料各組顯著高于正常肌組織，隨種植時間延長，上述分子水平逐漸下調。移植早期(7d)，HSNGLPL-PU-TGF-β組的ER Stress分子mRNA水平顯著高于BDO-PU和HSNGLPL-PU組。
　　結論:
　　體內、外條件下，HSNGLPL多肽修飾的聚氨酯均可富集TGF-β分子。肌內植入后，預富集的TGF-β自HSNGLPL多肽-聚氨酯材料快速釋放并可能干預肌內炎性反應和肌組織纖維化，并影