Akt1磷酸化核基質(zhì)結(jié)合蛋白SATB1及其功能研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,作為PI3K/Akt信號通路的關(guān)鍵分子,能夠通過磷酸化激活或抑制其下游一系列底物如GSK-3、Bad、easpase9、NF-Rb和p27kipl等參與細胞增殖、分化、凋亡和代謝的調(diào)節(jié)。Akt在腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移中也起著重要作用,它的持續(xù)活化能夠抑制腫瘤細胞的凋亡,促進腫瘤的生長。因此深入研究Akt調(diào)節(jié)機體正常的生理狀態(tài)和參與疾病發(fā)生的分子機制也成為當前的熱點。
   核基質(zhì)結(jié)合蛋白SATB1(s

2、pecial AT-rich sequences binding protein 1,SATBI)能夠自身多聚化,圍繞異染色質(zhì)形成籠狀結(jié)構(gòu)分布在細胞核中,SATBI不僅結(jié)合染色質(zhì)DNA的核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(matrix attachment regions,MARs),也結(jié)合核基質(zhì)(nuclear matrix),能夠使DNA錨定在核基質(zhì)并形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)(loop)。SATBl的磷酸化、乙酰化和小泛素化樣修飾(sumoylation)可調(diào)節(jié)其D

3、NA結(jié)合能力和細胞核內(nèi)亞結(jié)構(gòu)的定位;SATB1與多種蛋白質(zhì)相互作用,能夠募集染色質(zhì)重塑復(fù)合物和組蛋白修飾酶,實現(xiàn)對其靶基因表達的時空特異性調(diào)控。SATBI在調(diào)節(jié)細胞分化、細胞凋亡、腫瘤生長與轉(zhuǎn)移和X染色體失活等方面起著重要作用。
   已有研究證實SATB1能被PKC磷酸化,SATB1的這種磷酸化狀態(tài)與其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)能力相關(guān)。根據(jù)現(xiàn)有的研究和Scansite的數(shù)據(jù)我們推測SATB1能夠被Akt磷酸化。由數(shù)據(jù)顯示SATB1含有2個候選

4、磷酸化位點,分別是S47(RGRLGST)和S557(IRRFLSL)。首先構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA4/SATBlwt,利用免疫沉淀方法及免疫印跡法驗證蛋白激酶Aktl與野生型SATB1分子間的激酶底物關(guān)系;接下來將SATB1分子的47位點的絲氨酸進行定點突變,獲得Pgex4t-1/SATB1$47A、Pgex4t-1/SATBlS47D,應(yīng)用體外激酶活性分析方法確定SATB1分子被Aktl磷酸化的位點。同時還設(shè)計了免疫共沉淀方法和GST

5、-pulldown實驗鑒定Aktl與SATBI分子間是否存在相互作用。最后我們構(gòu)建了Pgfp-N2/SATBI,去探索SATB1在被Aktl磷酸化之后對于其在細胞內(nèi)的分布情況、穩(wěn)定性的影響。
   根據(jù)研究,我們得出了以下結(jié)論。第一,Aktl特異性磷酸化SATBI的第47位點的絲氨酸;第二,Aktl與SATB1之問沒有相互作用;第三,SATBI被Aktl磷酸化后影響了自身的穩(wěn)定性。深入研究Aktl調(diào)節(jié)機體正常的生理狀態(tài)和參與疾病

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