HBV編碼蛋白HBx通過(guò)核基質(zhì)結(jié)合蛋白SATB1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞失巢凋亡抵抗的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：原發(fā)性肝癌(primary liver cancer)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,發(fā)病率逐年上升,其中約一半發(fā)生在中國(guó)。大多數(shù)肝癌為肝細(xì)胞癌(HCC),而HBV感染是世界公認(rèn)的原發(fā)性肝細(xì)胞癌的主要病因和促轉(zhuǎn)移因素。HCC易出現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移,血清HBV DNA水平較高的HCC患者轉(zhuǎn)移及死亡的風(fēng)險(xiǎn)更高。在惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過(guò)程中,脫落腫瘤細(xì)胞能抵抗失巢凋亡,這是轉(zhuǎn)移的早期重要事件和先決條件,是轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志性特征。有研究表明,SATB1通

2、過(guò)錨著特異性的DNA序列并招募染色質(zhì)重組復(fù)合體來(lái)調(diào)控基因的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株中沉默SATB1的表達(dá)后,錨著非依賴性生長(zhǎng)被抑制并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生失巢凋亡。我們研究的目的是明確HBV、SATB1及肝癌細(xì)胞失巢凋亡之間的關(guān)系及其具體調(diào)控機(jī)制
　　方法：我們收集了40對(duì)肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本(20對(duì)HBV相關(guān)性肝癌及癌旁標(biāo)本,20對(duì)無(wú)HBV感染的肝癌及癌旁標(biāo)本),用實(shí)時(shí)定量PCR及western blot檢

3、測(cè)了肝癌及相應(yīng)癌旁組織、5株不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株(2株HBV DNA陽(yáng)性細(xì)胞Hep3B和HepG2.2.15,以及3株HBV DNA陰性細(xì)胞SK-HEP-1, HepG2和SMMC-7721)中SATB1的表達(dá)差異,以觀察SATB1與肝癌轉(zhuǎn)移及HBV感染等相關(guān)臨床病理特征的關(guān)系;用包含HBV全基因組的質(zhì)粒pBlue-HBV(可編碼產(chǎn)生HBV各種蛋白)轉(zhuǎn)染低表達(dá)SATB1的肝癌細(xì)胞株HepG2,并檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中SATB1的表達(dá)及細(xì)胞

4、失巢凋亡和軟瓊脂單克隆形成情況,進(jìn)一步研究HBV、SATB1和失巢凋亡之間的關(guān)系;將7種HBV編碼基因的質(zhì)粒及空載體分別轉(zhuǎn)入HepG2肝癌細(xì)胞,檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中SATB1的表達(dá),以篩選出調(diào)控SATB1表達(dá)的具體HBV編碼蛋白;然后用包含此病毒基因的載體進(jìn)一步穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2及Hep3B細(xì)胞,檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中SATB1的表達(dá)、失巢凋亡和軟瓊脂單克隆形成情況,以明確HBV編碼蛋白在HBV調(diào)控SATB1表達(dá)及肝癌細(xì)胞抗失巢凋亡效應(yīng)中的作

5、用;用PI-3K、JNK、ERKs和P38 MAPK信號(hào)分子的抑制劑分別處理細(xì)胞,以篩選HBV編碼蛋白調(diào)控SATB1表達(dá)及細(xì)胞失巢凋亡抵抗的具體信號(hào)通路;然后用羅丹明標(biāo)記的活化caspases檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中caspase-3, caspase-8和caspase-9的表達(dá),并檢測(cè)死亡受體標(biāo)記蛋白FADD的表達(dá)差異,以明確SATB1抑制失巢凋亡的具體凋亡通路。
　　結(jié)果：在40對(duì)肝癌及相應(yīng)癌旁組織中,有22對(duì)(55％)標(biāo)本

6、的癌組織中SATB1的表達(dá)顯著高于(≥2.0-fold)相應(yīng)癌旁組織;并且,SATB1的高表達(dá)與 HBV感染(p<0.05)、腫瘤大小(p<0.05)、分化程度(p<0.05)、門脈轉(zhuǎn)移(p<0.05)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p<0.05)相關(guān)。此外,SATB1在包含 HBV全基因組的HepG2.2.15細(xì)胞及高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株 SK-HEP-1中高表達(dá)(以低轉(zhuǎn)移潛能的Hep3B細(xì)胞為對(duì)照,△CT值:7.36±0.08 vs10.27±0.06

7、;7.46±0.09 vs10.27±0.06;**P<0.01)。用pBlue-HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染低表達(dá) SATB1的HepG2細(xì)胞后,SATB1表達(dá)增高(△CT:7.01±0.03 vs9.59±0.02;**p<0.01),失巢凋亡率降低(22.68±1.25％ vs35.51±0.86％;**p<0.01),軟瓊脂單克隆形成增加(24.89±2.23％ vs2.11±1.02％;**p<0.01)。增強(qiáng)或沉默肝癌細(xì)胞中SATB1的表

8、達(dá)后,脫落肝癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡的能力也隨之被增強(qiáng)(失巢凋亡率:21.20±0.81％ vs31.79±0.88％;克隆形成率:22.09±1.84％ vs10.67±1.14％;**p<0.01)或抑制(失巢凋亡率:40.51±1.81％ vs27.48±0.79％;克隆形成率:4.91±0.76％vs17.98±1.57％;**p<0.01)。將7個(gè)構(gòu)建的病毒基因質(zhì)粒及pEGFP-N1空載體分別轉(zhuǎn)入 HepG2肝癌細(xì)胞中,結(jié)果顯示 H

9、BV編碼蛋白 HBx能顯著上調(diào) SATB1的表達(dá)(△CT:7.69±0.07 vs10.02±0.03;**p<0.01)。用pEGFP-N1-HBx質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 HepG2和Hep3B細(xì)胞,結(jié)果表明 HepG2-HBx及Hep3B-HBx細(xì)胞中SATB1的表達(dá)隨著 HBx表達(dá)的增加而顯著增高(△CT:7.59±0.05 vs9.86±0.02;7.79±0.06 vs10.39±0.02;**p<0.01),細(xì)胞失巢凋亡減少(21.8

10、6±1.79％ vs34.12±1.32％;19.87±1.98％ vs35.07±1.56％;**p<0.01),軟瓊脂單克隆形成增多(22.32±1.82％ vs2.24±0.95％;26.57±1.94％ vs5.04±0.99％;**p<0.01)。然后用SATB1-siRNA1轉(zhuǎn)染 HepG2-HBx細(xì)胞,檢測(cè)結(jié)果顯示在 HBx高表的HepG2-HBx細(xì)胞中,SATB1表達(dá)受抑制后細(xì)胞抵抗失巢凋亡的能力也顯著降低,細(xì)胞凋亡率增

11、高(35.34±1.59％ vs23.37±2.05％;**p<0.01),細(xì)胞軟瓊脂單克隆形成減少(6.27±1.11％ vs23.18±1.83％;**p<0.01)。用PI-3K、JNK、ERK1/2和P38 MAPK信號(hào)分子的抑制劑分別處理HepG2-HBx細(xì)胞24h后,與僅用DMSO處理的HepG2-HBx細(xì)胞相比,ERKs和P38 MAPK信號(hào)分子抑制劑顯著抑制了SATB1的表達(dá)(△CT:9.92±0.03 vs7.59±0

12、.06;10.17±0.04 vs7.59±0.06;**p<0.01)及細(xì)胞抵抗失巢凋亡的能力,細(xì)胞失巢凋亡率增加(36.80±1.61％vs25.21±1.54％;38.51±2.19％ vs25.21±1.54％;**p<0.01),細(xì)胞克隆形成率降低(8.32±1.05％ vs22.45±2.26％;6.36±1.37％ vs22.45±2.26％;**p<0.01)。各組細(xì)胞中caspase-3, caspase-8和casp

13、ase-9的活化程度檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著 HBx及SATB1表達(dá)的增高,caspase-8及caspase-3的活化顯著下降(**p<0.01),而各組細(xì)胞中的caspase9均有活化但與 HBx及SATB1的表達(dá)水平無(wú)顯著相關(guān)。接著我們又檢測(cè)了上述各組細(xì)胞中caspase-8的上游激活因子 FADD的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn) FADD的表達(dá)水平與 SATB1的表達(dá)相反,SATB1負(fù)向調(diào)控 FADD(△CT:9.02±0.02 vs6.84±0.0

14、3;6.88±0.03 vs8.41±0.06;**p﹤0.01)。并且,FADD在 HepG2-HBx中的表達(dá)低于 HepG2肝癌細(xì)胞(△CT:7.75±0.03 vs6.31±0.05;**p﹤0.01),而在 HepG2-HBx-SATB1 siRNA1細(xì)胞中的表達(dá)卻高于 HepG2-HBx細(xì)胞(△CT:5.77±0.04 vs7.69±0.02;**p﹤0.01)。
　　結(jié)論：我們的研究證實(shí),HBV能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞中SATB

15、1的表達(dá)及抑制脫落肝癌細(xì)胞的失巢凋亡;在HBV編碼的七個(gè)蛋白(HBp、HBx、HBs、preS2、preS1、HBc及HBe)中,HBV主要通過(guò)HBx激活ERK及p38 MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)SATB1的表達(dá),并通過(guò)SATB1抑制Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)的表達(dá)及caspase-8和caspase-3的活化,進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的失巢凋亡抵抗。此項(xiàng)研究闡明了HBV編碼蛋白HBx誘導(dǎo)SATB1表達(dá)和抑制失巢凋亡的作用及分子機(jī)制,為HB