隱孔酸E抗甲型流感病毒活性及其作用機制初步探究.pdf

1、目的：
　　流感病毒感染至今仍是世界性公共衛(wèi)生難題，隨著耐藥毒株的不斷出現(xiàn)，抗流感病毒藥物的效果變得較為有限。因此，探尋新型藥物、尤其是在不同于現(xiàn)有藥物作用位點發(fā)揮作用的抗流感病毒藥物變得尤為重要。前期有研究結(jié)果表明，隱孔菌（Cryptoporus volvatus）提取物能在體外和體內(nèi)有效地抑制流感病毒的復(fù)制，但其中發(fā)揮主要作用的活性成分尚未證實。為闡明隱孔菌中具有抗流感病毒活性的有效成分，本課題對隱孔菌進行了系統(tǒng)的化學(xué)成分分析

2、，并對隱孔菌90％乙醇提取物中八種較為主要的單體化合物進行活性篩選。此外，初步探究了隱孔酸E抑制甲型流感病毒在MDCK細胞中復(fù)制的作用機制，為后續(xù)開發(fā)隱孔菌用于治療甲型流感病毒感染提供數(shù)據(jù)支持。
　　方法：
　　通過病毒滴度測定實驗，計算隱孔菌中8種化合物抑制甲型流感病毒活性的IC50，篩選到具有較強抗流感病毒活性的化合物隱孔酸E(Cryptoporic acid E，CAE)進行研究。通過MTT法測定化合物對于流感病毒宿主

3、細胞增殖活力的影響，選取抗流感病毒活性較好且不影響宿主細胞增殖活力的化合物濃度用于后續(xù)研究。通過測定在不同MOI時，隱孔酸E對流感病毒生長曲線的影響，進一步確認隱孔酸E的抗流感病毒活性。通過間接免疫熒光染色和TCID50法測定病毒滴度，確定隱孔酸E對不同亞型的四種流感毒株復(fù)制的抑制作用。將CAE與宿主細胞或流感病毒共孵育后測定病毒滴度以及階段加藥實驗，對CAE的作用位點和時期進行初步確定。通過定量RT-PCR法檢測CAE對流感病毒3種R

4、NA合成的影響。通過微基因組實驗檢測CAE對流感病毒聚合酶活性的抑制作用，結(jié)合對vRNP核轉(zhuǎn)位情況的觀察結(jié)果，從而初步確定CAE抑制甲型流感病毒在MDCK細胞中復(fù)制的作用機制。
　　結(jié)果：
　　由抗流感病毒活性篩選實驗和病毒生長曲線的測定結(jié)果可知，隱孔酸E能劑量依賴、時間依賴地抑制流感病毒在宿主細胞中的復(fù)制，MTT實驗證明CAE對流感病毒宿主細胞毒性較小。間接免疫熒光染色結(jié)果和病毒滴度的測定結(jié)果表明，CAE的抗甲型流感病毒能

5、力并不局限于單一毒株：隱孔酸E對于H1N1和H3N2兩種亞型的4種流感毒株都具有較強的抗病毒活性。階段加藥實驗的結(jié)果說明，CAE主要在甲型流感病毒生命周期的中期發(fā)揮抑制作用。定量RT-PCR的結(jié)果表明，CAE能劑量依賴地抑制流感病毒vRNA，cRNA和mRNA的合成。微基因組實驗的結(jié)果證實：CAE能夠顯著抑制病毒RNA聚合酶的活性，從而抑制流感病毒基因組在MDCK細胞中的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。此外，還發(fā)現(xiàn)CAE能直接靶向病毒顆粒，影響流感病毒的感