透邪解毒法抗流感病毒作用機(jī)制研究.pdf

1、本課題在深入分析流感病毒致病機(jī)理基礎(chǔ)上,采用目前通用的流感動(dòng)物模型、細(xì)胞模型,以肺指數(shù)、病死率為評(píng)價(jià)指標(biāo),證實(shí)金柴抗病毒膠囊對(duì)不同免疫狀態(tài)流感動(dòng)物模型的防治作用,以病毒-細(xì)胞、病毒-機(jī)體-免疫系統(tǒng)的相互作用作為研究對(duì)象,運(yùn)用激光掃描共聚焦、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR以及免疫印記Western-Blot等方法,從細(xì)胞、分子水平明確金柴抗病毒膠囊抗流感病毒的作用靶點(diǎn),闡明抗流感病毒作用機(jī)制。
　　 本研究分三部分。文獻(xiàn)綜述:主要對(duì)流感

2、病毒致病機(jī)理以及中醫(yī)藥防治流行性感冒研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)；實(shí)驗(yàn)研究:在明確金柴抗病毒膠囊防治流感作用基礎(chǔ)上,從病毒-細(xì)胞、病毒-機(jī)體-免疫兩方面對(duì)其抗病毒機(jī)制進(jìn)行研究。理論探討:結(jié)合流行性感冒的特點(diǎn),探討透邪解毒法防治流行性感冒的理論依據(jù)和優(yōu)勢(shì)。
　　 1透邪解毒法治療流行性感冒的理論探討
　　 流行性感冒屬于中醫(yī)“時(shí)行感冒¨時(shí)行傷寒¨時(shí)行疫病”等范疇,其病因?yàn)椤胺菚r(shí)之氣”挾“時(shí)行疫毒”侵襲人體所致。由于社會(huì)發(fā)展、環(huán)境變遷以

3、及人們生活、就醫(yī)習(xí)慣的影響,流行性感冒的病邪性質(zhì)和病機(jī)變化不再遵循固有的規(guī)律,探索其病機(jī)特點(diǎn)、證候演變規(guī)律,并以此確立新的治則治法是中醫(yī)藥行業(yè)的重要任務(wù)。
　　 透邪解毒法是針對(duì)流行性感冒“在表之邪猶存,趨里之邪易郁化熱”的病機(jī)特點(diǎn)而設(shè),以此法為組方依據(jù)的金柴抗病毒膠囊由金銀花、柴胡、蟬蛻等藥組成,全方配伍輕清宣透、引邪外出,清熱解毒祛除病因,參以培補(bǔ)正氣抵御外邪,體現(xiàn)了“早期治療,截?cái)嗖?shì),防止傳變”的立法宗旨。
　　

4、 2實(shí)驗(yàn)研究
　　 2.1金柴抗病毒膠囊防治流感的作用研究
　　 采用甲型H1N1流感病毒鼠肺適應(yīng)株(FM/1/47株和PR/8/34株)滴鼻感染正常免疫狀態(tài)和免疫低下小鼠造成肺炎模型,以肺指數(shù)和病死率為評(píng)價(jià)指標(biāo),評(píng)價(jià)金柴抗病毒膠囊對(duì)不同免疫狀態(tài)小鼠甲型流感的防治作用,并與目前世界衛(wèi)生組織推薦治療流感主要藥物達(dá)菲進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:金柴抗病毒膠囊對(duì)正常免疫狀態(tài)和免疫低下小鼠肺部炎癥均有明顯的治療和預(yù)防作用,并在減輕肺

5、指數(shù)、降低小鼠死亡率、延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間上,與達(dá)菲比較無顯著性差異(P>0.05)。
　　 2.2金柴抗病毒膠囊抗流感病毒作用機(jī)制研究
　　 2.2.1對(duì)流感病毒吸附環(huán)節(jié)的影響
　　 通過藥物先與細(xì)胞作用1小時(shí)后,加入流感病毒再作用1小時(shí)的方法,采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR,檢測(cè)藥物作用細(xì)胞后細(xì)胞中流感病毒HA-mRNA表達(dá)含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:金柴抗病毒膠囊能顯著減少細(xì)胞中流感病毒HA-mRNA的表達(dá)含量,提示金柴

6、抗病毒膠囊可通過干預(yù)病毒對(duì)細(xì)胞吸附環(huán)節(jié)發(fā)揮抗流感病毒作用。
　　 2.2.2對(duì)流感病毒-細(xì)胞膜融合的影響
　　 通過藥物與流感病毒同時(shí)作用細(xì)胞的方法,采用激光掃描共聚焦結(jié)合PH值敏感熒光染料,觀察金柴抗病毒膠囊對(duì)流感病毒感染細(xì)胞后胞內(nèi)PH值變化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:金柴抗病毒膠囊能顯著降低流感病毒感染細(xì)胞后引起胞內(nèi)PH酸化的程度,提示金柴抗病毒膠囊可干預(yù)病毒.細(xì)胞膜融合環(huán)節(jié)發(fā)揮抗流感病毒的作用。
　　 2.2.3

7、對(duì)流感病毒轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的影響
　　 利用病毒感染細(xì)胞1小時(shí)后,加入相應(yīng)稀釋濃度的金柴抗病毒膠囊,作用48-72小時(shí)后,采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法,檢測(cè)細(xì)胞中流感病毒多聚酶PA亞基mRNA表達(dá)含量,觀察金柴抗病毒膠囊對(duì)流感病毒多聚酶PA亞基mRNA表達(dá)的影響,進(jìn)一步探討其抗流感病毒作用靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:金柴抗病毒膠囊能顯著降低細(xì)胞中流感病毒多聚酶PA亞基mRNA表達(dá)含量,提示金柴抗病毒膠囊抗病毒的作用機(jī)制與干預(yù)流感病毒的轉(zhuǎn)錄和

8、復(fù)制有關(guān)。
　　 2.2.4對(duì)流感病毒釋放環(huán)節(jié)的影響
　　 利用病毒感染細(xì)胞1小時(shí)后,加入相應(yīng)稀釋濃度的金柴抗病毒膠囊,作用72小時(shí),采用熒光Elisa的方法,觀察金柴抗病毒膠囊對(duì)流感病毒NA活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:金柴抗病毒膠囊對(duì)流感病毒NA活性沒有明顯的抑制作用,提示金柴抗病毒膠囊對(duì)流感病毒的釋放環(huán)節(jié)沒有影響作用。
　　 2.2.5對(duì)病毒載量及γ-IFNmRNA表達(dá)的影響
　　 通過甲型H1N1流感

9、病毒鼠肺適應(yīng)株(FM/1/47株)感染正常小鼠造成肺炎模型的方法,檢測(cè)流感病毒感染小鼠后第1天、第3天、第5天以及第7天小鼠肺組織中病毒載量、γ-IFNmRNA的動(dòng)態(tài)變化情況,探討金柴抗病毒膠囊調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)制抗病毒作用機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:金柴抗病毒膠囊大、中、小3個(gè)劑量組對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中病毒載量的表達(dá)均有明顯的降低作用,對(duì)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)小鼠肺組織中γ-IFNmRNA的表達(dá)含量均有明顯的升高作用,提示金柴抗病毒膠囊通過上調(diào)γ-IFNmR

10、NA的表達(dá)發(fā)揮抗病毒作用。
　　 2.2.6對(duì)干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白表達(dá)的影響
　　 采用免疫印記Western-Blot的方法,觀察流感病毒感染小鼠后第1天、第3天、第5天以及第7天肺組織中天然抗流感病毒蛋白-干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白(IFITM3)的動(dòng)態(tài)變化情況,探討金柴抗病毒膠囊抗流感病毒的作用靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:金柴抗病毒膠囊在流感病毒感染早期即可調(diào)節(jié)機(jī)體產(chǎn)生IFITM3發(fā)揮抗病毒作用,并且在其后幾天內(nèi)與模型組比較,其含量