流感病毒寡核苷酸檢測(cè)芯片的初步研究.pdf

1、流行性感冒是一種由流感病毒引起的上呼吸道傳染病。流感極易在人群中傳播并造成大流行。歷史上每一次流感的大流行都會(huì)造成成千上萬人死亡。流感病毒分為甲、乙、丙三型，甲型流感又包含15個(gè)血凝素亞型和9個(gè)神經(jīng)氨酸酶亞型。其中，常引起人群發(fā)病的是甲型流感病毒中的H1N1和H3N2以及乙型流感病毒。流感病毒基因?yàn)榉止?jié)段的單負(fù)鏈RNA，其中甲型和乙型包含8個(gè)RNA節(jié)段，丙型包含7個(gè)RNA節(jié)段，缺少神經(jīng)氨酸酶節(jié)段。在這8個(gè)RNA節(jié)段中，編碼核蛋白(nuc

2、leoprotein，NP)和膜蛋白(matrixprotein，MP)的節(jié)段具有型特異性，NP還是流感病毒分型的依據(jù)；甲型流感病毒中血凝素(hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidases，NA)極易變異，具有亞型特異性，是甲型流感病毒亞型劃分的依據(jù)。 目前流感病毒的檢測(cè)方法主要有病毒分離法、血清學(xué)檢測(cè)、流感病毒抗原檢測(cè)和多重PCR檢測(cè)方法。無論是哪一種檢測(cè)方法，都無法同時(shí)對(duì)眾多型和亞型的流感病毒進(jìn)

3、行精確的分型。因而有必要尋找一種高效、高通量和快速的流感病毒檢測(cè)和分型方法。基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)為同時(shí)對(duì)流感病毒進(jìn)行檢測(cè)和分型提供了可能的途徑。它可以同時(shí)對(duì)成千上萬個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)，因而是一種高通量、平行化的檢測(cè)方法。 基因芯片根據(jù)探針類型分為cDNA芯片，DNA芯片和寡核苷酸芯片，近年來的研究表明，寡核苷酸芯片比cDNA芯片和DNA芯片有著更高的特異性，同時(shí)其靈敏度也能滿足目前病原體檢測(cè)的要求。寡核苷酸芯片的制作既可以采用芯片上原

4、位合成短的寡核苷酸探針的方法，也可以采用合成儀人工合成15～80mer的寡核苷酸探針然后固定在支持物上的方法制備。這兩種方法中，后者相對(duì)簡單易行，且系統(tǒng)的開放性較好。而在探針的長度的選擇上，60mer的寡核苷酸探針被認(rèn)為能取得特異性和靈敏度之間的平衡，并且多數(shù)情況下只需一個(gè)探針即可檢測(cè)一個(gè)基因。 本課題用oligo6.0軟件針對(duì)流感病毒的NP、MP、HA和NA基因設(shè)計(jì)了77條60mer的寡核苷酸探針。為了保證設(shè)計(jì)的探針具有高度的

5、特異性和靈敏度，設(shè)計(jì)時(shí)使探針Tm值在85±5℃之間，GC含量介于40％～60％，且探針內(nèi)部和探針之間不易形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在Blast比對(duì)中，與其它基因的同源性小于70％，連續(xù)相同堿基的數(shù)量不超過18個(gè)。寡核苷酸探針合成和純化后，用芯片打印儀固定在玻片上。隨后，從省CDC取回的甲型流感病毒株H1N1、H3N2和乙型流感病毒株中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后以限制性顯示(RestrictionDisplay,RD)技術(shù)進(jìn)行熒光標(biāo)記后與芯片雜交，并

6、根據(jù)雜交結(jié)果篩除與相應(yīng)本型流感病毒樣品的雜交信號(hào)的信噪比低于2，以及與其它型流感病毒樣品雜交的信噪比高于1.5的寡核苷酸探針，得到33條高靈敏度、高特異性的寡核苷酸探針。 為了提高芯片的特異性和靈敏度，我們還對(duì)標(biāo)記方法、片基和雜交條件等進(jìn)行優(yōu)化。 1.標(biāo)記方法的優(yōu)化本部分研究比較了通用引物聯(lián)合標(biāo)記(UniversalPrimerLabeling，UPL)、RD直接標(biāo)記、RD間接標(biāo)記和隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記這四種方法的標(biāo)記效率

7、和可重復(fù)性，將流感病毒RNA分別用四種標(biāo)記方法處理后與流感病毒寡核苷酸檢測(cè)芯片雜交，用SPSS10.0對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明UPL方法在標(biāo)記物雜交的熒光強(qiáng)度、信噪比、探針真陽性率和可重復(fù)性等方面均高于隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄摻入標(biāo)記法，而與其它兩種RD標(biāo)記方法相當(dāng)，但標(biāo)記過程相對(duì)簡單。 2.片基的選擇本部分研究對(duì)Corning、多聚賴氨酸包被的DAKO玻片和多聚賴氨酸處理的顯微鏡載玻片這三種片基進(jìn)行了評(píng)估。將熒光標(biāo)記的綠色熒光蛋白(

8、greenfluorescentprotein，GFP)基因的寡核苷酸探針分別打印在這三種片基上，并按常規(guī)方法進(jìn)行洗脫，GenePix4100A掃描后用GenePix6.0軟件分析點(diǎn)的大小、熒光強(qiáng)度和背景熒光強(qiáng)度，以此來衡量3種片基的均一性和固定效率，并通過不同濃度梯度的60mer寡核苷酸探針的雜交實(shí)驗(yàn)來衡量片基對(duì)雜交效率的影響。結(jié)果顯示，3種片基的均一性都較好，而多聚賴氨酸包被的DAKO和Corning芯片的固定效率和雜交效率優(yōu)于國產(chǎn)

9、芯片。研究認(rèn)為多聚賴氨酸包被的DAKO片基性能優(yōu)異，價(jià)格便宜，適合于大規(guī)模的基因芯片研究。 3.優(yōu)化雜交溫度，雜交時(shí)間和雜交液等條件。結(jié)果表明，雜交溫度40℃，雜交時(shí)間4～8h，雜交液含30％甲酰胺，5×SSC和0.1％SDS為流感病毒寡核苷酸芯片最適的雜交條件。 4.質(zhì)控芯片的建立：為了監(jiān)測(cè)芯片檢測(cè)的過程中是否存在人為的操作失誤以及降低芯片檢測(cè)的假陽性率和假陰性率，研究中設(shè)計(jì)GFP寡核苷酸探針為陽性對(duì)照探針，并構(gòu)建了克

10、隆有GFP基因的克隆載體G-T和體外轉(zhuǎn)錄載體G-S，以提供可摻入到DNA或者RNA樣品中與之一起標(biāo)記的陽性對(duì)照品。該研究針對(duì)GFP基因設(shè)計(jì)的4條60mer寡核苷酸探針和1條陽性對(duì)照探針通用引物串聯(lián)序列與流感病毒寡核苷酸探針一起打印在DAKO玻片上，并構(gòu)建了GFP基因的克隆載體和體外表達(dá)載體，將從這兩種重組載體上獲得的GFP基因的RNA、DNA片段和人全血樣品中的DNA用RD技術(shù)擴(kuò)增標(biāo)記，將標(biāo)記的樣品和熒光標(biāo)記的通用引物分別與芯片雜交，用

11、GenePix4000B掃描熒光信號(hào)后并用SPSS11.0對(duì)掃描的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，GFP基因探針與相應(yīng)的樣品雜交時(shí)出現(xiàn)陽性信號(hào)，陽性對(duì)照探針在所有的雜交中均出現(xiàn)陽性信號(hào)，而空白對(duì)照則未檢測(cè)熒光信號(hào)。因而建立的質(zhì)控系統(tǒng)具有較好的敏感性和特異性，可以用于基因芯片中的質(zhì)量監(jiān)控，為芯片的檢驗(yàn)過程提供了一種有效的質(zhì)控方法。 5.臨床樣品的檢驗(yàn)研究。研究中應(yīng)用流感病毒寡核苷酸檢測(cè)芯片對(duì)21例具有流感樣癥狀患者的咽漱液樣品進(jìn)行了檢

12、測(cè)。其方法是，從咽漱液樣品中抽提出病毒RNA，逆轉(zhuǎn)錄后用RD標(biāo)記使樣品標(biāo)上熒光物質(zhì)，然后與包含有實(shí)驗(yàn)中篩選出的33條高靈敏度、高特異性的流感病毒寡核苷酸探針，4條GFP基因陽性對(duì)照探針和5條蟲熒光素酶基因探針的芯片進(jìn)行雜交，芯片洗脫、掃描后采用GenePixPro6.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析。同時(shí)實(shí)驗(yàn)中分別針對(duì)這三種流感病毒的NP、MP、HA和NA設(shè)計(jì)了10對(duì)引物，通過4組多重逆轉(zhuǎn)錄PCR對(duì)臨床樣品進(jìn)行鑒定，并與芯片的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)照。雜交結(jié)果

13、表明，芯片的特異性和靈敏度均較高，陰性對(duì)照和陽性對(duì)照在芯片上均發(fā)揮著較為可靠的監(jiān)測(cè)功能。在這21例樣品中，H1N1有5例，而H3N2和乙型流感各1例。與多重逆轉(zhuǎn)錄PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。 綜上所述，本研究自行設(shè)計(jì)制備了流感病毒寡核苷酸芯片，并用于實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化和臨床樣品的檢驗(yàn)。結(jié)果表明，流感病毒寡核苷酸芯片的特異性和靈敏度均較好，檢驗(yàn)型基因芯片為臨床流感病毒寡核苷酸檢測(cè)芯片的研制提供了基礎(chǔ)，可望對(duì)早期流感流行的快速診斷和預(yù)防做出