Statin-caffeine抗流感病毒作用研究.pdf

1、研究目的： 本課題應(yīng)用不同流感病毒株(H5N1、H3N2、H1N1)，分別在細(xì)胞模型和動(dòng)物模型觀察其體內(nèi)外抗病毒效果，并為抗病毒機(jī)制研究提供依據(jù)。 研究方法： (1)體外抗H1N1和H3N2流感病毒作用 本實(shí)驗(yàn)采用MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行體外抗流感病毒作用的實(shí)驗(yàn)研究，分先感染病毒后加藥、先加藥后感染病毒兩種方法進(jìn)行研究，藥物作梯度稀釋?zhuān)繚舛?個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)達(dá)菲陽(yáng)性對(duì)照組，病毒對(duì)照組和正常細(xì)胞對(duì)照組。37℃

2、、5％CO2，飽和濕度培養(yǎng)72h，每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變(CPE)情況并記錄，據(jù)CPE實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷藥物的作用效果。用Reed-Mueneh法計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度(EC50)。以藥物劑量的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞CPE抑制率為縱坐標(biāo)繪圖。探討不同給藥方式下，其量效關(guān)系曲線走勢(shì)，及藥物對(duì)流感病毒的抑制作用。 (2)構(gòu)建流感小鼠模型 分別構(gòu)建H5N1禽流感、H1N1和H3N2人流感小鼠模型。BALB／e小鼠隨機(jī)分組，以乙醚

3、輕度麻醉后，分別滴鼻感染H5N1、H1N1和H3N2流感病毒，每只10μl。并按不同的劑量(Statin 50μg/caffeine 200μg或Statin 25μg/caffeine 200μg)，不同的給藥方式(滴鼻或灌胃)、不同的處理方式(預(yù)防或治療)，觀察藥物在小鼠體內(nèi)的抗流感作用。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、病毒對(duì)照和空白對(duì)照。從感染之日起，連續(xù)觀察14d，觀察小鼠的發(fā)病癥狀。 (3)肺組織病理檢測(cè) 在H3N2和

4、H1N1流感病毒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，在病毒感染后第5天和14天，每組分別處死5只小鼠；在H5N1流感病毒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，在病毒感染后第9和13天，每組分別處死5只小鼠。打開(kāi)胸腔分別取氣管及肺臟，肉眼觀察記錄各組小鼠肺大體病變情況。并按常規(guī)方法做組織切片(HE染色)，在光學(xué)顯微鏡觀察各組動(dòng)物肺及氣管的病理變化。 (4)熒光定量RT-PCR分析 用TRIZOL法提取肺組織中的RNA，檢測(cè)樣品的A260／280比值在1.8～2.0之間，采

5、用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)小鼠肺內(nèi)H3N2、H1N1、H5N1流感病毒核酸的量，探討藥物對(duì)流感病毒NP基因復(fù)制的抑制作用。 研究結(jié)果： (1)體外抗H1N1流感病毒作用 在病毒吸咐前和在病毒吸咐后用藥，statin／caffeine在體外均具有抗病毒活性，Caffeine、Statin、statin／caffeine、達(dá)菲的半數(shù)有效濃度(EC50)分別為45.29／47.46ug／ml、10.39／10.

6、69ug／ml、30.23／30.56ug／ml和53.72／46.29ug／ml。且在不同的給藥方式下，其量效關(guān)系曲線走勢(shì)比較接近，說(shuō)明藥物對(duì)流感病毒的抑制作用接近。聯(lián)合用藥組statin／caffeine在病毒吸咐前用藥的效果優(yōu)于病毒吸咐后用藥。 (2)體外抗H3N2流感病毒作用 在病毒吸咐前和病毒吸咐后用藥，statin／caffeine在體外均具有較強(qiáng)的抗H3N2流感病毒的作用。caffeine、Statin、s

7、tatin／caffeine、達(dá)菲的半數(shù)有效濃度(EC50)分別為45.72／46.76ug／ml、11.53／11.24ug／ml、30.29／33.50ug／ml和48.36／45.37ug／ml。且抑制H3N2流感病毒致細(xì)胞病變的作用都隨著藥物劑量的增加而增強(qiáng)，隨藥物濃度增加，其抗病毒活性增強(qiáng)，且聯(lián)合用藥組statin／caffeine在病毒吸咐前用藥的效果優(yōu)于病毒吸咐后用藥。 (3)體內(nèi)抗H5Nl流感病毒作用 H

8、5N1流感動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，statin 50μg／caffeine 200μg預(yù)防滴鼻組和達(dá)菲200μg治療灌胃組的肺組織病變程度相近。說(shuō)明statin／caffeine對(duì)H5N1病毒感染引起的肺組織病理改變有一定的抑制作用，與達(dá)菲灌胃的效果相似。與達(dá)菲200μg治療滴鼻組(J組)相比，statin 50μg／caffeine 200μg預(yù)防滴鼻組(A組)和馬抗-IgG預(yù)防滴鼻組(G組)的H5特異性病毒核酸量相對(duì)較低(P<0.05)，其他組

9、間無(wú)差別。結(jié)果提示，statin／caffeine能抑制H5N1流感病毒在肺臟的復(fù)制，且優(yōu)于達(dá)菲滴鼻的效果，與馬抗-IgG預(yù)防滴鼻的效果相似。 (4)體內(nèi)抗H3N2流感病毒作用 H3N2流感動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，與達(dá)菲200μg預(yù)防滴鼻組(Ⅰ組)相比，statin50μg／caffeine 200μg預(yù)防滴鼻(A組)和灌胃組(E組)、利巴韋林200μg預(yù)防滴鼻組(G組)和達(dá)菲200μg治療灌胃組(J組)的肺組織病變程度明顯減輕(P

10、<0.05)。同時(shí)，這些組間肺組織病變程度相近。說(shuō)明statin／caffeine對(duì)H3N2病毒感染引起的肺組織病理改變有一定的抑制作用，且優(yōu)于達(dá)菲滴鼻的效果，與達(dá)菲灌胃的效果相似。與statin 50μg／caffeine200μg預(yù)防灌胃組(E組)相比，statin 50μg／caffeine 200μg治療滴鼻組(B組)、statin 25μg/caffeine 200μg預(yù)防滴鼻組(C組)和治療滴鼻組(D組)、病毒唑200μg治

11、療灌胃組(H組)和達(dá)菲200μg預(yù)防滴鼻組(Ⅰ組)的H3特異性病毒核酸量相對(duì)較高(P<0.05)，其他組間無(wú)差別。提示聯(lián)合應(yīng)用statin／caffeine能抑制H3N2流感病毒在肺臟的復(fù)制，且優(yōu)于達(dá)菲滴鼻和病毒唑治療灌胃的效果，且聯(lián)合應(yīng)用statin／caffeine預(yù)防給藥的效果優(yōu)于治療給藥的效果，statm高劑量(50μg)的效果要優(yōu)于低劑量(25μg)的效果。 (5)體內(nèi)抗H1N1流感病毒作用 H1N1流感動(dòng)物實(shí)

12、驗(yàn)中，statin 50μg/caffeine 200μg治療滴鼻組(B組)和預(yù)防灌胃組(E組)與利巴韋林200μg預(yù)防滴鼻組(G組)和達(dá)菲200μg治療灌胃組(J組)的肺組織病變程度相近，提示聯(lián)合應(yīng)用statin／caffeine對(duì)H1N1流感病毒感染引起的肺組織病理改變有一定的抑制作用，且與達(dá)菲和利巴韋林的效果相似。與利巴韋林200μg預(yù)防滴鼻組(G組)和達(dá)菲200μg治療灌胃組(J組)相似，statin 50μg／caffeine

13、200μg治療滴鼻組(B組)和預(yù)防灌胃組(E組)有相對(duì)高的Ct均值，說(shuō)明這些組小鼠體內(nèi)的H1特異性病毒核酸量相對(duì)較低。 結(jié)果提示，聯(lián)合應(yīng)用statin／caffeine能抑制H1N1病毒在肺臟的復(fù)制，且預(yù)防和治療的效果均較好，與利巴韋林和達(dá)菲的效果相似。 結(jié)論： 1、聯(lián)合應(yīng)用statin／caffeine在體外有明顯的抗H3N2和H1N1流感病毒作用，其抑制流感病毒致細(xì)胞病變的作用隨著藥物劑量的增加而增強(qiáng)，且呈明

14、顯的量效關(guān)系，且病毒吸咐前用藥的效果優(yōu)于病毒吸咐后用藥。 2、在流感動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合應(yīng)用statin 50μg／caffeine 200μg可預(yù)防并緩解H5N1／H3N2／H1N1流感病毒感染的癥狀，有效抑制肺組織損傷，并抑制病毒在肺內(nèi)的復(fù)制，且效果相當(dāng)于或優(yōu)于達(dá)菲。在H3N2流感動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，高劑量聯(lián)合用藥(statin50μg／caffeine200μg)的功效要高于低劑量聯(lián)合用藥(statin 25μg／caffeine 2