TET1酶催化核酸堿基羥基化選擇性的化學研究.pdf

1、目的:
　　作為催化氧化脫甲基的酶，TET1(ten-eleven translocation)酶能夠誘導5-甲基胞嘧啶(5mC)發(fā)生羥化生成5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)，而后，又被證明能夠催化胸腺嘧啶(T)，轉化生成5-羥甲基尿嘧啶(5hmU)。研究表明許多中藥成分能抑制其作用，但機制尚未明確。為了探索藥物對TET1酶的作用，首先需要對TET1酶作用機制有更深入的了解。本實驗旨在從化學角度上研究TET1酶的作用機制以及其誘導的羥

2、基化反應的選擇性，從而總結出此類反應的一般規(guī)律，為研究核酸氧化脫甲基作用提供依據(jù)，為闡明核酸羥基化與蛋白羥基化的機制提供化學依據(jù)，為開發(fā)基于表觀遺傳學的新型的藥物提供理論參考。
　　方法:
　　本實驗以TET1酶為研究對象，選取具有代表性的有機化合物作為底物，包括環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷、乙基苯、異丙苯、水楊酸甲酯、水楊酸乙酯、2-氨基-4，6-二甲基嘧啶、6-甲基嘌呤、L-甲硫氨酸、茶堿以及5-乙基尿嘧啶等，在Fe(Ⅱ)和α-K

3、G存在的條件下發(fā)生體外反應。反應液采用氣質聯(lián)用和液質聯(lián)用的檢測方法分析，通過分析產物質譜圖中的碎片離子峰，判斷產物的結構以及被取代H原子的位置和發(fā)生反應C-H鍵的類型，從而推斷出TET1酶羥化核酸堿基反應的選擇性。
　　結果:
　　1)在T與TET1酶的反應液中檢測到5hmU和尿嘧啶（脫甲基產物）的存在，且生成5hmU的體外轉化率為9.2％;
　　2)環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷反應液中未檢測到羥化物的存在;
　　3)乙基

4、苯、異丙苯、2-氨基-4，6-二甲基嘧啶以及6-甲基嘌呤中檢測到羥化物存在，且OH取代發(fā)生在與雙鍵相連的-CH3上;
　　4)在水楊酸甲酯、水楊酸乙酯（-CH3與O原子相連）、L-甲硫氨酸、(-CH3與S原子相連)、茶堿（-CH3與N原子相連）的反應液中均檢測到羥化物的離子峰;
　　5)5-乙基尿嘧啶反應液中并沒有檢測到尿嘧啶（脫乙基產物）的存在。
　　結論:
　　在α-KG、Fe(Ⅱ)存在的條件下，TET1酶能

5、催化T中-CH3上的H原子羥基化，生成5hmU。能被TET1酶催化羥基化的C-H鍵主要有四類，即烯丙型C-H鍵以及與O、S、N相連的-CH3上的C-H鍵。乙基以及異丙基上的與端基H原子，不能被TET1酶催化羥基化。這是因為與烯丙型C-H鍵和與O、S、N相連的C-H鍵，受p-π共軛，或O、S、N的吸電子誘導效應（-Ⅰ）影響，具有較小的解離能。而乙基以及異丙基上端基C-H鍵具有較大的解離能。這提示TET1酶能催化DNA核酸堿基中的甲基的羥基